Mekanik Geri Dönü üm:

Para o cálculo do tamanho amostral utilizou-se a fórmula de Fisher e Belle (1993). A amostra calculada foi de 137 pacientes, utilizando-se um intervalo de confiança de 95% e uma precisão de 5%, para a positividade de 10% para Mycobacterium tuberculosis, dos exames processados na STLAC HCFMB. Os dados obtidos foram inicialmente descritos

3. Material e Métodos 28 em termos de variáveis quantitativas contínuas e discretas. Os dados demográficos da população estudada foram expressos em média ± desvio padrão. Para as variáveis qualitativas foram confeccionadas tabelas com as distribuições de freqüências e percentagens.

Descritos os dados, o teste do χ2 forneceu informações entre a positividade dos exames pela BAAR, técnica de PCR e Cultura.

Das amostras pesquisadas no escarro foram calculadas a sensibilidade, especificidade e teste preditivo positivo da PCR e da baciloscopia em relação à cultura, considerada o teste padrão-ouro. Foi considerado estatisticamente significante valor do p < 0,05.

4. Resultados e Discussão 30 Foram estudadas 130 amostras de materiais biológicos de pacientes atendidos na Instituição e nas UBS de toda a região, no período de março de 2012 a abril de 2013. Os pacientes tinham idade média de 52,4 ± 16,7 anos, variando de 16 a 86 anos, sendo 75 (57,6%) homens e 55 (42,4%) mulheres. A faixa etária predominante foi 20 a 59 anos, correspondendo a 75 (57, 6%) dos 130 investigados (Tabela 3).

Tabela 3. Dados demográficos dos 130 pacientes investigados. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Idade N (%) Homem (N) Mulher (N)

(0 – 19 anos) 2 (1,7%) 0 2

(20 – 59 anos) 75 (56,2%) 43 32

(≥ 60 anos) 45 (35,4%) 26 19

Sem informação 8 (6,9%) 6 2

Total 130 (100%) 75 55

Na tabela 4 estão descritos os dados demográficos dos pacientes que apresentaram resultado positivo para investigação de Mycobacterium spp.

Foram confirmados 44 pacientes com idade variando de 24 a 77 anos sendo 32 (72,7%) homens e 12 (27,3%) mulheres. A idade média dos pacientes foi de 49,8±15,0 anos e a faixa etária predominante foi de 20 a 59 anos, correspondendo a 30 (68,2%).

Tabela 4. Dados demográficos dos 44 pacientes com resultado positivo para Mycobacterium spp. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Idade N (%) Homem (N) Mulher (N)

(0 – 19 anos) 0 (0,0%) 0 0

(20 – 59 anos) 30 (68,2%) 23 7

(≥ 60 anos) 13 (29,5%) 8 5

Sem informação 1 (2,3%) 1 0

Total 44 (100%) 32 12

Esses dados são semelhantes aos descritos por outros autores. Watanabe e Rufino-Netto (2001) encontraram 78,3% casos notificados na faixa etária 20 a 49 anos dos 521 pacientes investigados. Seiscento (2012) investigando TB pleural no estado de SP

4. Resultados e Discussão 31 encontrou os maiores coeficientes de incidência entre os 20 e 29 anos no sexo feminino e entre 30 e 59 anos no sexo masculino. Com relação ao sexo, é descrito uma ampla predominância no sexo masculino, observando-se a incidência de tuberculose na proporção 2:1 – homem: mulher (WATANABE e RUFFINO-NETTO, 2001; LIMA et al., 2008; BONA et al., 2011; SEISCENTO, 2012; CALSOLARI et al., 2015).

Quanto à procedência das amostras, observou-se que 53 (40,7%) pacientes residiam na cidade de Botucatu e 77 (59,2%) pertenciam a outras cidades, apresentando um número maior provenientes de São Manuel 10 (7,7%); Areiópolis 4 (3,1%); Itatinga 4 (3,1%); Laranjal Paulista 4 (3,1%) e Pardinho 4 (3,1%). Em 10 (7,7%) pacientes não foi possível determinar a procedência (Tabela 5).

Tabela 5. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 130 pacientes, Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Procedência N % Homem Mulher

Botucatu 53 40,7 30 23 São Manuel 10 7,7 6 4 Areiópolis 4 3,1 2 2 Itatinga 4 3,1 2 2 Pardinho 4 3,1 2 2 Laranjal Paulista 4 3,1 1 3 Outros 41 31,5 22 19 Sem informação 10 7,7 8 2 Total 130 100 73 57

Quanto à procedência das amostras com resultado positivo, observou-se que 23 (52,3%) pacientes residiam na cidade de Botucatu e 20 (45,4%) pertenciam a cidades da região, apresentando um número maior de pacientes provenientes das cidades de São Manuel 10 (22,7%) e Areiópolis 2 (4,5%) (Tabela 6).

4. Resultados e Discussão 32 Tabela 6. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 44 pacientes positivos, Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Procedência N % Homem Mulher

Botucatu 23 52,3 18 5 São Manuel 10 22,7 7 3 Areiópolis 2 4,5 2 0 Itatinga 1 2,3 0 1 Pardinho 0 0 0 0 Laranjal Paulista 1 2.3 0 1 Outros 6 13,6 3 3 Sem informação 1 2,3 1 0 Total 44 100 31 13

As amostras biológicas estudadas corresponderam a 44 (33,8%) escarros, 42 (32,3%) lavados broncoalveolares, 17 (13,1%) urinas, 16 (12,3%) líquidos pleurais, oito (6,2%) líquidos cefalorraquidianos e três (2,4%) líquidos ascíticos. Foram incluídos todos os líquidos biológicos e urinas que deram entrada para investigação de tuberculose na STLAC do HCFMB e os escarros com baciloscopia positiva. Dez escarros com baciloscopia negativa e com importante evidência clínica de TB (sintomático respiratório e constitucional) foram incluídos no estudo (Tabela7).

Tabela 7. Materiais biológicos, Seção Técnica de Laboratório Clínico Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Amostras N % Escarro 44 33,8 Lavado broncoalveolar 42 32,3 Urina 17 13,1 Líquido pleural 16 12,3 Líquido cefalorraquidiano 8 6,2 Líquido ascítico 3 2,3 Total 130 100

4. Resultados e Discussão 33 Nesse estudo, os materiais biológicos foram investigados pela utilização de técnicas de PCR (ITS-PCR e pesquisa do gene hsp65) diretamente da amostra, para pesquisa de Mycobacterium spp. e seu resultado comparado com a metodologia tradicional a qual utiliza a baciloscopia e cultura.

Quando avaliamos a positividade das metodologias em todos os materiais biológicos investigados, observamos que a cultura apresentou positividade inferior à baciloscopia e a PCR. Isso se deve, provavelmente, ao tamanho da amostra, pois, seis culturas não tiveram resultados ou foram negativas (uma amostra de escarro com baciloscopia positiva não foi realizada a cultura, duas culturas se apresentaram contaminadas, uma foi identificada como uma MNT e outra que apresentou apenas um bacilo na baciloscopia).

Existem diversos fatores que podem estar relacionados ao sucesso do crescimento em cultura para as micobactérias, e conforme já descrito, a qualidade da amostra é fundamental para um bom desempenho do teste. Atualmente são conhecidas mais de 150 espécies de MNT, a maioria cresce em aminoácidos, glicerol e sais minerais, porém, algumas espécies necessitam de suplementos, além da temperatura de crescimento ser variável e oscilar de 25°C a 45°C de acordo com a espécie. Acredita-se que qualquer um desses fatores possa estar relacionado ao desempenho inferior da cultura, quando comparada a baciloscopia e PCR (HADDAD et al., 2005; NUNES et al., 2014).

Observou-se positividade para Mycobacterium spp. em 31,6% quando utilizada a técnica de ITS-PCR, 26,1% pela baciloscopia e 22,4% pela cultura (p= 0,00) (Tabela 8). A técnica hsp65 apresentou positividade de 20,0%.

4. Resultados e Discussão 34 Tabela 8. Positividade entre as técnicas, ITS-PCR, hsp65, BAAR e culturas dos Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

LBA : Lavado broncoalveolar; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; LAsc: Líquido Ascítico; LP: Líquido Pleural.

** Para as culturas o N=39 amostras

*comparação entre BAAR + e PCR+, p=0,00;

# _{comparação entre BAAR + e Cultura+, p=0,00;}

& _{comparação entre PCR+ e Cultura+, p=0,00.}

Realizaremos a apresentação dos resultados e a discussão separadamente de escarros e outros materiais biológicos.

 Análise dos escarros

Foram investigados 44 escarros. Foram positivos pela baciloscopia 34 e destes 31 foram confirmados pela técnica de PCR. Dos 10 escarros negativos na baciloscopia, dois foram positivos pela PCR, sendo um deles identificado como M. iranicum pelo seqüenciamento com 100% de compatibilidade (tabela 9).

Tabela 9. Positividade de escarros pelo ITS-PCR e baciloscopia, Seção Técnica de Laboratório Clínico Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

ITS + ITS - Total

BAAR + 31 3 34 BAAR - 2 8 10 Total 33 11 44 p = 0,93 Amostras ITS-PCR N % hsp65 N % BAAR N % Culturas N % Escarro (n=44)** 33 75,0 20 45,5 34 77,3 28 71,8 LBA (n=42) 5 11,9 3 7,1 0 0,0 0 0,0 LCR (n=8) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9 0 0,0 0 0,0 LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 LP (n=16) 2 12,5 2 12,5 0 0,0 0 0,0 Total (n=130) 41*& _{31,6 26 20,0 34*}# _{26,1 28}#& _22,4

4. Resultados e Discussão 35 Neste estudo, referente aos escarros, o desempenho da PCR quando comparado às baciloscopias positivas não apresentou diferença estatisticamente significante. Autores descrevem resultados com a investigação de amostras pulmonares para pesquisa de Mycobacterium spp. diretamente do material clínico (SUFFYS et al., 2001; OGUSKU e SALEM, 2004; GHOLOOBI et al., 2014). Ogusku e Salem (2004) obtiveram resultados estatisticamente semelhantes nos exames positivos e negativos por ambas as técnicas. Entretanto, outros autores descrevem desempenho da PCR superior quando comparado à baciloscopia. Lima et al (2008), investigando pacientes para diagnóstico de TB pulmonar obtiveram 54,2% de baciloscopias positivas e 77,5% quando realizadas por PCR enquanto Aniet al (2009) obtiveram 28% de baciloscopias positivas e 84% quando realizadas por PCR (ANI et al., 2009; LIMA et al., 2008).

Estudos relatam também positividade inferior da PCR em relação às baciloscopias e culturas. Assis et al (2007) obtiveram 14 amostras de escarro com resultado negativo na PCR que apresentavam cultura positiva. Autores descrevem que um dos pontos importantes para o uso da PCR no diagnóstico é a obtenção de DNA de qualidade a partir de amostras clínicas. A presença de substâncias inibidoras da enzima Taq polimerase durante o processo de extração pode estar relacionada ao sucesso da técnica (BAZZO et al., 2004; ASSIS et al., 2007). Desta forma, acredita-se que alguma substância inibidora possa ter influenciado os três materiais biológicos com baciloscopia positiva que se apresentaram negativos na PCR.

Em função da praticidade e da rapidez diagnóstica, a baciloscopia direta da amostra respiratória para investigação de tuberculose é amplamente empregada e estabelecida para pesquisa de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Vários estudos relatam o desempenho da baciloscopia frente à cultura, considerada padrão-ouro (GUERRA; REGO; CONDE, 2008; NOGUEIRA; ABRAHÃO; MALUCELLI, 2000; NUNES et al., 2008; ASSIS et al., 2011).

No presente estudo a sensibilidade da baciloscopia frente à cultura revelou uma sensibilidade de 100% e especificidade de 54% (Tabela 10).

4. Resultados e Discussão 36 Tabela 10. Comparação da positividade da baciloscopia com a cultura em amostras de escarro.

Cultura + Cultura - Total

BAAR + 28 5 33

BAAR - 0 6 6

Total 28 11 39

Avaliação da baciloscopia positiva comparada à cultura

Valor Intervalo confiança 95%

Sensibilidade 1 (0,87 – 1)

Especificidade _{0,54 (0,28 – 0,78)}

VPP* 0,84 (0,78 – 0,96)

RV positiva** 2,2 (1,1 - 4,2)

*VPP – Valor preditivo positivo **Razão de verossimilhança positiva

ASSIS et al. (2011) descrevem sensibilidade de 58% e especificidade de 96% e Guerra et al., (2008) relatam que a sensibilidade da baciloscopia pode chegar até 80%.

Apesar de a cultura ser considerada o padrão ouro para o diagnóstico da tuberculose pulmonar (LIMA et al., 2008; SBPT, 2011), em nosso estudo a baciloscopia revelou cinco amostras positivas que se apresentaram negativas na cultura: duas amostras contaminadas que posteriormente foram identificadas como M. tuberculosis, uma amostra que apresentou 1 bacilo na baciloscopia na qual o paciente foi diagnosticado com TB pleural, além de duas amostras negativas sem causa aparente. Esse fato justifica a baixa especificidade da baciloscopia.

Na tabela 11 encontra-se a comparação dos resultados da PCR em escarros utilizando como padrão a cultura.

4. Resultados e Discussão 37 Tabela 11. Comparação da positividade da ITS- PCR com a cultura em amostras de escarro.

Cultura + Cultura - Total

PCR + 28 2 30

PCR - 0 9 9

Total 28 11 39

Avaliação da PCR positiva comparada à cultura

Valor Intervalo confiança 95%

Sensibilidade 1 (0, 87 - 0,10)

Especificidade 0,81 (0, 52 –0,94)

VPP* 0,93 (0,87 – 0,99)

RV positiva** 5,5 (1,57 – 19,2)

*VPP – Valor preditivo positivo **Razão de verossimilhança positiva

Ao avaliar o desempenho da PCR em relação à cultura obteve-se 100% de sensibilidade e 81% de especificidade. Semelhante à baciloscopia, a PCR revelou uma especificidade inferior à cultura devido a duas amostras positivas na PCR que se apresentaram negativas na cultura: uma amostra que apresentou um bacilo na baciloscopia e paciente diagnosticado com TB pleural, e uma amostra negativa sem causa aparente.

Vários autores descrevem o desempenho da PCR para detecção do Mycobacterium spp. comparado à baciloscopia e cultura. Furini et al. (2013) descrevem resultados da PCR comparados à cultura para investigação pulmonar, a sensibilidade e a especificidade foram 100% e 83%, respectivamente. Assis et al. (2011), relatam sensibilidade 94,7% e especificidade 96,6% para PCR e cultura 52,6% sensibilidade e 99,4% especificidade. Parekh et al. (2006) relatam sensibilidade de 91.5% e especificidade de 86% (PAREKH et al., 2006; ASSIS et al., 2011; FURINI et al., 2013). Alguns autores apresentam resultados semelhantes e outros, resultados discordantes, com isso, existem relatos de PCR com sensibilidade variando de 58,3% a 94,7% (LIMA et al., 2008; CHAGAS et al., 2010; HASAN et al., 2012).

 Análise dos outros materiais biológicos

Neste estudo, a técnica de ITS-PCR mostrou uma positividade maior quando comparada a baciloscopia e cultura com diferença estatisticamente significante incluindo toda a casuística do estudo. Além de duas amostras de escarro positivas pelo PCR que se apresentaram negativas na baciloscopia, a técnica de PCR revelou sete amostras de líquidos e

4. Resultados e Discussão 38 uma urina positivas (9,3%), enquanto que nenhuma destas amostras foi positiva pela baciloscopia ou cultura (Tabela 12).

Tabela 12. Positividade entre as técnicas ITS-PCR, hsp65, BAAR e culturas de outros Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

LBA : Lavado broncoalveolar; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; LAsc: Líquido Ascítico; LP: Líquido Pleural.

*comparação entre BAAR + e PCR+, p=0,00;

& _{comparação entre PCR+ e Cultura+, p=0,00.}

A baciloscopia e a cultura das amostras dos outros materiais biológicos foram negativas na totalidade de amostras investigadas e apresentaram positividade de 9,3% quando investigadas pela PCR. Esses dados são semelhantes aos de outros autores. Ani et al. (2009) investigando Tb extrapulmonar obtiveram resultados negativos pela baciloscopia e cultura, enquanto que, pela PCR essas amostras foram positivas. GHOLOOBI et al. (2014) investigando diversos espécimes clínicos, obtiveram 75% de sensibilidade e 83,3% de especificidade para a baciloscopia, enquanto que a PCR apresentou 58,3% de sensibilidade e 100% de especificidade. (ANI et al., 2009; GHOLOOBI et al., 2014).

Lima et al. (2008) descrevem que o desempenho da baciloscopia e cultura quando comparadas à PCR está diretamente ligado à qualidade da amostra. Em amostras paucibacilares a PCR pode detectar até 1-20 bacilos/mL, enquanto que na baciloscopia são necessários 5.000-10.000 bacilos/mL para um resultado eficiente (LIMA et al., 2008; SILVA JUNIOR, 2012). O desempenho da baciloscopia torna-se mais crítico em relação às amostras extrapulmonares. Devido à própria característica da amostra (diluição), a quantidade de bacilos disponíveis dificulta a técnica de baciloscopia. Segundo Gholoobi et al. (2014) a baixa sensibilidade na baciloscopia pode estar relacionada também a falta de padronização na técnica como: investigação de apenas uma amostra e até mesmo a erros laboratoriais Amostras ITS-PCR N % hsp65 N % BAAR + N % Culturas N % LBA (n=42) 5 11,9 3 7,1 0 0,0 0 0,0 LCR (n=8) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9 0 0,0 0 0,0 LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 LP (n=16) 2 12,5 2 12,5 0 0,0 0 0,0 Total (n= 86) 8*& 31,6 6 20,0 0* 0,0 0& 0,0

4. Resultados e Discussão 39 (GHOLOOBI et al., 2014).

Das formas de tuberculose extrapulmonar, a tuberculose pleural é a mais comum encontrada no adulto imunocompetente e, em cerca de 20% dos casos, está associada com lesão pulmonar ativa (LOPES et al., 2006a). A positividade da baciloscopia no líquido pleural ocorre em 5% dos casos e na cultura pode chegar a 40%.

No presente estudo, entre as 10 amostras positivas encontradas pela técnica PCR e negativas pela baciloscopia e cultura, destaca-se líquido pleural de paciente que apresentou vários derrames pleurais e internações no HCFMB, com realização de exames laboratoriais para diagnóstico de TB sempre negativos: Adenosina Deaminase (ADA), baciloscopia, cultura em LJ e em Myco-F®). Posteriormente identificou-se a espécie por PCR sendo M. tuberculosis.

Diversos estudos destacam a importância da Biologia molecular para identificação do Mycobacterium spp. Entre as maiores vantagens no emprego dessas tecnologias está: a agilidade no diagnóstico o qual poderá ser realizado até 48 horas para identificação da espécie (ITS-PCR; IS6110; PRA-PCR; sequenciamento de DNA) e detecção do DNA/RNA micobacteriano mesmo em amostras paucibacilares, o que geralmente não ocorre com a metodologia tradicional (ROTH et al., 2000; OGUSKU e SALEM, 2004; LIMA et al., 2008; DORA et al., 2008; CHIMARA et al., 2008; FREITAS; SIQUEIRA; ALBANO, 2009; POROCA et al., 2009; SENNA et al., 2011).

No presente estudo a pesquisa de Mycobacterium spp. no material biológico apresentou positividade superior quando realizada pela técnica ITS-PCR em comparação à técnica hsp65, correspondendo a 41 e 26 amostras, respectivamente (Tabela 13 e Figuras 3 e 4).

4. Resultados e Discussão 40 Tabela 13. Positividade entre as técnicas ITS-PCR e hsp65 para pesquisa de Mycobacterium spp. dos Materiais biológicos. Unidade de Pesquisa Experimental - UNIPEX Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Amostras hsp65 N % ITS-PCR N % Escarro (n=44) 20 45,4 33 75,0 LBA (n=42) 3 7,1 5 11,9 LCR (n=8) 0 0,0 0 0,00 Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9 LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,00 LP (n=16) 2 6,3 2 12,5 Total (n=130) 26 20,0 41 31,6 1 2 3 4 5 6 7 8 300 200 100

Figura 3. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de Mycobacterium spp. em materiais biológicos utilizando a técnica ITS-PCR. Amostra 1: negativa; amostra 2: positiva; amostra 3: controle positivo; amostras 4 e 5: negativas; amostra 6:controle negativo; amostra 8:marcador de 100pb.

4. Resultados e Discussão 41 Como o objetivo do estudo não foi identificar o total de amostras de MNT encontradas e sim, avaliar a técnica de PCR para identificação de micobactérias diretamente do material clínico, apenas algumas amostras foram sequenciadas para confirmar espécies de micobactérias.

Das 44 amostras positivas, 41 foram confirmadas pelo PCR, sendo 28 identificadas como M. tuberculosis com a pesquisa do fragmento IS6110, seis identificadas pelo sequenciamento (duas M. chelonae, duas M. imunogenum, uma M. iranicum e uma M.chelonae/M.abscessus/M.massiliensis) e sete amostras sem identificação de espécie (Tabela 14 e figura 5). 439 300 200 100 1 2 3 4 5 6 7

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de fragmento do gene hsp65 para identificação de Mycobacterium spp. em materiais biológicos. Amostras 1,2,6: positivas; amostras 3,4,5: negativas; amostra 7: marcador de 100pb.

4. Resultados e Discussão 42 Tabela 14. Identificação das espécies de micobactérias dos 41 materiais biológicos positivos pela PCR. Pesquisa dos fragmentos IS6110 e seqüenciamento de DNA utilizando os fragmentos ITS-PCR e gene hsp65. Unidade de Pesquisa Experimental-UNIPEX da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015. Amostras

/espécies M.tuberculosis M.chelonae M.iranicum M.imunogenum

M.chelonae/ M.abscessus/ M.massiliensis Mycobacterium spp. Escarro 27 1 1 1 3 LBA 1 1 1 2 LCR Urina 1 Lasc LP 1 1 Total 28 2 1 2 1 7

Tabela 15. Identificação de Mycobacterium spp. pelo sequenciamento de DNA. Instituto de Biotecnologia (IBTEC) Unesp, Botucatu.

Amostra Espécie Código* Posição** Similaridade

Escarro M. iranicum HQ009484.1 213-298 100%

Escarro M. immunogenum AM421285.1 107-292 99%

Escarro M. chelonae DQ986509.1 104-245 100%

LBA M. immunogenum AM421285.1 134-222 100%

LBA M. chelonae/M. abscessus/M.massilliense KT779852.1 KT779846.1 JX270661.1 138-169 138-169 149-180 100% 100% 100% LBA M. chelonae KT779863.1 6-40 100%

LBA: Lavado broncoalveolar

* identifica a sequência do GenBank com maior score encontrada pelo algoritmo BLAST; ** Localiza a sequência obtida dentro da sequência do GenBank.

Das 34 amostras de escarro com baciloscopia positiva, 28 foram identificadas como M. tuberculosis pela cultura. As mesmas 34 amostras quando testadas pela PCR, confirmaram positividade em 31 delas, sendo que, 27 confirmaram ser M. tuberculosis, uma

4. Resultados e Discussão 43 foi identificada como M. chelonae e em duas não foram identificadas as espécies. Outra que apresentou um bacilo na baciloscopia e cultura negativa foi identificada na PCR como M. imunogenum.

Das 10 amostras de escarro com baciloscopia negativa, duas foram positivas quando testadas pela PCR e uma identificada como M. iranicum.

Os outros materiais biológicos corresponderam a cinco LBA (um M.chelonae, um M. imunogenum, um M.chelonae/M.abscessus/M.massiliensis e duas amostras sem identificação de espécie), dois LP (um M. tuberculosis e um sem identificação de espécie) e uma urina sem identificação de espécie (Tabela 14 e 15).

As 26 amostras com resultado positivo pela técnica hsp65 para pesquisa do gênero, não foram conclusivas pela técnica PRA-PCR para identificação das espécies, com o DNA obtido diretamente do material clínico. O padrão de bandas se apresentou fraco e descorado. Entretanto, sabe-se que outros autores descrevem com sucesso o uso da técnica PRA para identificação das espécies de micobactérias isoladas em meios de cultura sólidos ou líquidos (COSTA et al., 2010; CHIMARA et al., 2008).

A técnica ITS-PCR para pesquisa do gênero Mycobacterium demonstrou uma positividade semelhante à baciloscopia e cultura, em relação às amostras de escarro, e

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de fragmento IS6110 para identificação de M. tuberculosis em materiais biológicos. Amostras 1,2,3,4,5: positivas; Amostra 6: controle negativo; Amostra 7: controle positivo; Amostra 8:marcador de 100pb.

541

300 200 100

4. Resultados e Discussão 44 superior em relação às amostras de outros materiais biológicos, o mesmo acontecendo com a pesquisa do fragmento IS6110 para pesquisa do M. tuberculosis (Figura 5). Desta forma, podemos destacar a PCR como uma importante ferramenta para pesquisa de Mycobacterium spp. diretamente do material biológico, caracterizando-a como uma técnica auxiliar de diagnóstico, principalmente em amostras de outros materiais biológicos. Tais resultados não excluem o uso das técnicas tradicionais de baciloscopia e cultura, mas sim podem determinar uma informação adicional para diagnóstico e tratamento.

O estudo também permitiu evidenciar a presença de MNT na população estudada de forma rápida e segura, porém, o elevado custo para utilização de seqüenciamento de DNA, inviabiliza sua aplicação na rotina. Levando em conta o aumento da ocorrência de MNT e sua conhecida resistência às drogas utilizadas para o tratamento da tuberculose, torna-se importante sua identificação prévia e mais estudos são necessários para o aprimoramento das técnicas.

Os prontuários dos pacientes investigados no estudo revelaram as condições associadas a cada caso. Nas tabelas 16, 17 e 18 estão descritas as com maior freqüência e associadas ao desempenho da Baciloscopia (Tabela 16), PCR (Tabela 17) e cultura (Tabela 18). As condições associadas mais prevalentes encontradas foram: 30 pacientes com Hipertensão arterial, 23 com doenças pulmonares (DPOC, asma, pneumonia bacteriana), 21 com outras infecções (criptococos; paracocidioidomicose; neurotoxoplasmose; herpes; citomegalovírus; chagas; sífilis; hepatites), 18 pacientes com doença renal (nefrolitíase, pielonefrite, transplantado), 14 pacientes com neoplasias, 10 pacientes com diabetes (DM) e seis pacientes com HIV.

4. Resultados e Discussão 45 Tabela 16. Análise das condições associadas com baciloscopias positivas em amostras de material biológico. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Variável N BAAR+ Risco

Relativo IC95% p Álcool 25 11 5,50 1,91 – 15,78 0,00 Fumo 47 14 2,72 0,99 – 7,50 0,04 Outras infecções* 21 3 0,46 0,12 – 1,72 0,24 Doenças pulmonares** 23 3 0,41 0,11 – 1,53 0,17 HAS*** _{30 4 0,40 0,12 – 1,29 0,12} doença renal**** _{18 2 0,35 0,07 – 1,65 0,12} Diabetes 10 1 0,33 0,04 – 2,75 0,28 HIV 6 1 0,33 0,03 – 3,22 0,32 Neoplasias 14 1 0,21 0,02 – 1,75 0,12 *criptococos;paracoccidioidomicose;neurotoxoplasmose;herpes;CMV(citomegalovírus);chagas;sífilis; hepatites;

** DPOC; Asma; Pneumonia bacteriana; *** Hipertensão arterial sistêmica;

**** nefrolitíase;pielonefrite;transplantado.

Tabela 17. Análise das condições associadas com ITS-PCR positivas em amostras de material biológico. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.

Variável N ITS-PCR + _Relativo Risco IC95% p

Álcool 25 14 5,50 1,82 – 12,79 0,00 Fumo 47 22 2,72 1,87 – 12,47 0,00 Outras infecções* _{21 3 0,46 0,08 – 1,06 0,05} Doenças pulmonares** 23 6 0,41 0,25 – 2,0 0,52 HAS*** 30 7 0,40 0,12 – 1,29 0,25 doença renal**** 18 3 0,35 0,10 – 1,41 0,13 Diabetes 10 3 0,33 0,22 – 3,79 0,91 HIV 6 1 0,33 0,02 – 2,52 0,22 Neoplasias 14 3 0,21 0,14 – 2,12 0,38

*criptococos; paracoccidioidomicose; neurotoxoplasmose; herpes; CMV(citomegalovírus); chagas; sífilis; hepatites;

** DPOC; Asma; Pneumonia bacteriana; *** Hipertensão arterial sistêmica;

4. Resultados e Discussão 46 Tabela 18. Análise das condições associadas com Culturas positivas em amostras de material

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