3.1. Hayvanlar ve Bakım Şartları
Çalışmamızda, Pamukkale Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Birimi’nden alınan 24 adet erkek Wistar Albino türü sıçanlar kullanılmıştır. Tüm denekler için önerilen optimum çevresel koşullar aynı merkez tarafından sağlanmış ve sıçanlar, ışıklandırması (12 saat aydınlık/karanlık siklusunda, 07:00-19:00 saatleri arası aydınlık), havalandırılması (%60-70 nem) ve oda ısısı (20-24 0C ) kontrol edilen bir odaya
yerleştirilmiştir.
3.2. Deneysel Uygulama
Bu çalışma; ergin dönemdeki sıçanlardan oluşmuştur. Sıçanlar 6’şar hayvan olmak üzere 4 gruba ayrılmıştur. Birinci grup sıçanlar normal sıçanlara 7 gün boyunca i.p. 300 mg/kg L-karnitin verilmiştir. İkinci grup sıçanlar hiçbir muamele görmemiştir ve birinci grup sıçanların kontrolü olmuştur. Üçüncü grup sıçanlara özel yem verilerek sülfit oksidaz yetersiz hayvanlar elde edilmiştir. Bu hayvanlara 7 gün boyunca i.p. 300mg/kg L- karnitin verilmiştir. Dördüncü grup sıçanlar sülfit oksidaz yetersiz olmuştur ve üçüncü grubun kontrolü olmuştur. İnceleme ve bulguların fotoğraflandırılmasında, Olympus BX51 marka ışık mikroskobu ve Olympus DP72 dijital kamera kullanılmıştır.
3.2.1. SOX Yetersizliği Olan Sıçan Oluşturulması
Gunnison ve arkadaşlarının tarif ettiği şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu metod ile yetersizliğin oluşturulması, enzimin kofaktörü ve esansiyel bir element olan Mo’un diyetten çıkarılması ile birlikte dışarıdan W verilerek Mo’un yerine W’in geçmesi esasına dayanır.
Bu çalışmada diyetten Mo çıkarılması işlemi sıçanlar için oluşturulmuş ve Amerikan Gıda Enstitüsü (American Institute of Nutrition) tarafından 1976 yılında kabul edilmiş özel bir yem kullanarak gerçekleştirilmiştir. Literatürde bu diyetin adı American Institute of Nutrition’ın baş harflerinin kısaltmaları ve yine bu enstitü tarafından kabul edildiği yıla (1976) atfen AIN-76 olarak geçmektedir ve teorik olarak hiç Mo içermemektedir. Hayvanların içme sularına 200 ppm dozunda W ilave etmek sureti ile yeni SOX enzimi sentezi esnasında W’in enzimin aktif bölgesi için Mo ile yarışmaya girerek onun yerine bağlanması amaçlanmıştır. SOX yetersizliğinin gelişip gelişmediği, hayvanların 3 hafta boyunca yukarıdaki gibi beslenmesini takiben karaciğer SOX enzim aktivitesinin ölçümü ile kontrol edilmiştir.
3.3. Reaktif Hazırlanması
Fiksatif Solüsyonu Hazırlama: % 37’lik formaldehitden 10 ml, distile sudan 90 ml
alınarak % 10’luk fiksatif solüsyonu hazırlanmıştır.
3.4. Uygulanan Teknikler
3.4.1. Doku Takip Yöntemi:
a. Alınan dokular formaldehitde 1 gece bekletildi. b. Akarsuda 30 dakika yıkandı.
c. %70’lik etil alkolde 1 saat bekletildi. d. %80’lık etil alkolde 1 saat bekletildi. e. %90’lık etil alkolde 1 saat bekletildi. f. %100’lık etil alkolde 1 saat bekletildi. g. Ksilende 1 saat bekletildi.
h. Ksilende 1 saat bekletildi. i. Parafinde 1 saat bekletildi. j. Parafinde 1 saat bekletildi.
k. Dokulara parafinle gömme ve etiketlenme işlemi yapıldı.
3.4.2. Histolojik Boyama
Hematoksilen-Eozin Boyama Yöntemi:
a. Bloklardan 5 μ’ luk kesitler alınıp ılık su havuzuna bırakıldı. b. Lamlarla dokular toplanır ve zembillere yerleştirildi.
c. Etuvde 2 saat 60 C’de bırakıldı.
d. Ksilende 2 seri halinde 30’ar dakika olmak üzere toplam 1 saat tutuldu.
e. Sırasıyla %100, %90, %80, %70’lik azalan etil alkol serilerinden toplam 10
dakika olacak şekilde geçirildi.
f. Alkolden çıkan preparatlar akar suda yıkandı. g. Hematoksilende 2,5-3 dakika bekletildi. h. Akar suda yıkandı.
i. Asit-alkole daldırılıp çıkartıldı. j. Akar suda yıkandı.
k. Amonyağa daldırılıp çıkartıldı. l. Akar suda yıkandı.
m. Eozinde 3-5 saniye tutuldu. n. Akar suda yıkandı.
o. Sırasıyla %70, %80, %90, %100’luk artan etil alkol serilerinde toplam 10 dakika
olacak şekilde geçirildi.
p. Ksilende 30 dakika bekletildi.
q. Entellan kullanılarak dokuların üzeri kapatıldı.
3.4.3. İmmunohistokimyasal boyama
Doku takip yöntemi tamamlanan testis bloklarından, mikrotom cihazıyla 5 µ’ luk kesitler alınıp, kesitler benmariye bırakıldı. Ardından uygulanan protokol sırası aşağıdaki gibidir: (Reaktifler için İnvitrogen Histostain-Plus kit kullanılmıştır.)
a. Kesitler, benmariden lamlara alınıp lam taşıma sepetine yerleştirildi. b. Lam taşıma sepeti etüvde 60 0C’de 1 gece bekletildi.
c. Ksilende, deparafinizasyon işlemi için 1 saat bekletildi.
d. Kesitler sırasıyla %100, %90, %80, %70’lik etil alkol serilerinde toplam 10
dakika bekletildi.
e. Alkolden çıkan preparatlar akarsuda yıkanarak 10 dakika PBS’de bırakıldı. Bu
aşamada kesitler PAP pen kullanılarak işaretlendi.
f. Dokulardaki endojen peroksidaz aktivitesi, % 30’luk H2O2: Metanol (1:9) karışımı
ile 30 dakikalık uygulamayla ortadan kaldırıldı.
g. PBS ile yıkanan kesitler, üzerlerine ilave edilen serum bloklama solüsyonu ile 10
dakika oda sıcaklığında bekletildi. (İnvitrogen, Camarillo, CA 93012, A.B.D.)
h. Kesitler üzerine OCT2 primer antikoru ilave edilerek 2 saat bekletildi. Bu
çalışmada kullanılan primer antikorlarun dilüsyonu 1:200 şeklindedir. Primer antikor PBS ile dilüe edildi.
i. Kesitler, PBS ile yıkandıktan sonra primer antikorlarla reaksiyon veren,
biotinlenmiş afiniteye sahip sekonder antikorlarla 20 dakika muamele edildi.
j. Tekrar PBS ile yıkanması yapılan kesitlere, biotinlenmiş-sekonder antikorlara
kolayca bağlanabilen horseradish peroksidaz konjugatı streptavidin (HRP-SA) 10 dakika kadar muamele edildi.
k. Kesitler son kez PBS ile yıkandıktan sonra kromojen boyası DAB ile 3-10 dakika
kadar muamele edildi.
l. Antijenin lokalizasyonunun daha iyi gözlenmesi için kesitlere hematoksilen (Merk
Harris’ hematoksilen) ile zıt boyama yapıldı.
m. Kesitler akarsu da yıkanmış ve sırasıyla %70, %80, %90, %100’lük etil alkol
serilerinde toplam 10 dakika bekletildi.
n. Dokuların üzeri entallan ile kapatıldı.
3.4.4. Doku Homojenizasyonu
K2HPO4 ve KH2PO4 ya da NaH2PO4 ve Na2HPO4 kullanılarak 400mMol olacak
şekilde çözelti hazırlandı. 50mMol olması için 0.4M PO4 tamponundan dilüsyon yapıldı.
50mM po4 tamponu içine EDTA tableti ilave edildi. pH 7.4 olacak şekilde solüsyon hazırlandı.
Homojenizasyon için 50mM EDTA’lı fosfat tamponu içine her 50ml için 1 tablet proteaz inhibitörü ilave edildi. Her karaciğer örneğinin homejenizasyonu için 5cc solüsyon örneklerin üzerine ilave edildi ve 11.000 g de 10 dakika santrifüj edildi. Supernatant alındı ve – 20°C dereceye kaldırıldı.
Cohen ve Fridovich tarafından önerilen metoda göre Wistar Albino sıçan karaciğer homojenatlarında sülfit oksidaz enzim aktivitesi tayin edildi. Bu yöntem; SOX aktivitesi ile SO=
3’e bir oksijen daha eklenerek SO=4 oluşması ve bu esnada açığa çıkan bir
elektronun, sitokrom c’de bulunan okside demirin Fe+3‘e transfer edilerek redüksiyona uğramasıyla okside formdan redükte forma geçen demirin absorbans artışına neden olması prensibine dayanır. Homojenizasyon işlemi sırasında elde edilen homojenat Tablo 3.1’de verilen reaksiyon karışımı ile 550 nm dalga boyunda oda sıcaklığında SOX aktivitesi kaydedilmiş ve absorbanstaki 0.100 birimlik artış 1 unite SOX aktivitesi olarak ifade edilmiştir.
Tablo 3.1 Wistar Albino sıçan karaciğer homojenatındaki SOX aktivitesinin tayini için
reaksiyon karışımının bileşenleri.
İçerik Stok Solusyonlar Eklenen Hacim (ml) Son Konsantrasyon
Tris-HCl pH:8,50 50 mM 1,6 80 mM Sitokrom c 0,2 mM 0,5 1 mM KCN 10 mM 0,1 1 mM Na2SO3 0,01 mM 0,1 0,001 mM
Homojenat 0,2
Ultra saf su 3 ml’ye tamamla Toplam hacim 3
3.4.6. Protein Miktar Tayini
Wistar Albino sıçanlara ait dokulardan elde edilen homojenatların protein miktarı tayini, BSA (sığır serum albumin) standart olarak kullanılarak Lowry vd (1951)’nin metoduyla yapıldı. Bu metod, alkali ortamda proteinlerin peptid bağlarının ve tinosin artıklarının bakır ile kompleks oluşturması prensibine dayanır.
1:10 veya 1:20 oranında seyreltilmiş olan fraksiyonlar test tüplerine 50µl hacimde alındı. Sonra % 2’lik bakır sulfat, %2’lik sodyum potasyum tartarat ve % 2’lik sodyum
karbonat iceren 0,1 N NaOH’in 1:1:100 oranında karışmasıyla oluşan 200µl alkali bakır reaktifi ile karıstırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sonunda, deiyonize distile su ile 1:1 oranında seyreltilmiş olan Folin (fosfomolibdik-fosfotungstik asit) reaktifinden her bir tupe 20µl ilave edildi. Folin reaktifini koyar koymaz hemen karıştırıldı ve 10 dakika daha inkübe edildi. Oluşan rengin şiddeti her bir tüp icin 660 nm’de köre karşı ölçüldü. Protein miktarları elde edilen eğim değeri kullanılarak hesaplandı.
3.4.7. Plazma Total Oksidan Kapasite (TOK) ve Total Antioksidan Kapasite (TAK) Ölçümü
Plazma total oksidan kapasite (TOK) ve total antioksidan kapasite (TAK) ölçümleri için santrifüje edilen kan örnekleri analize kadar -80 °C’de saklanmıştır.
Plazma total oksidan kapasite düzeyi (TOK) Erel’in geliştirdiği otomatize edilmiş bir yöntem ile kolorimetrik olarak ticari bir kit aracılığıyla (Rel Assay Diagnostic, Türkiye) ölçülmüştür.
Ölçümün prensibi örneğin içindeki oksidanların ferröz iyon-o-dianisidine kompleksinin ferrik iyona dönüşünün sağlanması ve bunun da asidik bir ortamda kromojen ile reaksiyona girerek absorbans artışına sebep olmasına dayanmaktadır. Ortamda bulunan gliserol bu reaksiyonun hızını yaklaşık üç katına çıkarmaktadır. Örnekte bulunan oksidanların (lipidler, proteinler vb) miktarıyla ilişkili olan rengin şiddeti 492 nm dalga boyunda ELISA okuyucu ile spektrofotometrik olarak ölçülmüş, sonuçlar μmol H2O2 Eqv/L birimi ile ifade edilmiştir.
Plazma total antioksidan kapasite düzeyi (TAK) yine Erel’in geliştirdiği otomatize edilmiş bir yöntem ile kolorimetrik olarak ticari bir kit aracılığıyla (Rel Assay Diagnostic, Türkiye) ölçülmüştür. Ölçümün prensibi örneğin içindeki tüm antioksidanların mavi-yeşil ABTS radikalini renksiz redükte ABTS haline getirmesi esasına dayanır. Spektrofotometrik olarak ölçülen absorbans değişikliği örneğin total antioksidan düzeyi ile ilişilidir. Deneklerin plazma total antioksidan kapasite düzeyleri 405 nm dalga
boyunda ELISA okuyucu ile spektrofotometrik olarak ölçülmüş sonuçlar μmol Trolox Eqv/L birimi ile ifade edilmişir.
3.4.8. Oksidatif Stres İndeksi (OSİ)
Oksidatif stres düzeyinin bir diğer göstergesi hesapla elde edilen Oksidatif Stres İndeksi (OSİ)’dir. Bu indeks çalışmamızda elde edilen TOK ve TAK değerleri kullanılarak aşağıdaki formül ile hesaplanmıştır:
OSİ = TOK (μmol H2O2 Eqv/L) / TAK (μmol Trolox Eqv/L) X 100
3.4.9. İstatistiksel Analiz
Total antioksidan kapasite, total oksidan kapasite ve oksidatif stres indeksi değerlerinin karşılaştırılmasında One-way ANOVA testi kullanıldı (SPSS programı version 11.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Elde edilen sonuçlar için p<0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi.