Araştırmada hayvan materyali olarak 11-12 haftalık, 150-250 g canlı ağırlıklı, 117 adet erkek Sprague-Dawley ırkı rat kullanıldı. Ratlar adaptasyon amacıyla 2 hafta süreyle 210C ± 2’de, 14:10 saat aydınlık-karanlık siklusunda, standart rat yemi (Purina, Kanada) (Tablo 4) ve su ile ad libitum beslendi. Ratlar adaptasyon ve araştırma süresince 240-250 cm2 alanda bir rat olacak şekilde, yonga talaşı altlıklı ve polikarbonat kafeslerde (Tecniplast, İtalya) barındırıldı (Harkness ve Wagner 1995).
Tablo 3.1. Purina rat yemi bileşimi
Yem Bileşimi Miktar % Birim
Kuru Madde en az 88.0
Ham Protein en az 23.0
Ham Selüloz en çok 5.0
Ham Kül en çok 8.0
HCL'de Çöz. Kül en çok 1.0 Kalsiyum en az-en çok 1-1.3
Fosfor en az 0.9
Sodyum en az-en çok 0.5-0.6
NaCl en çok 1.0 Lizin en az 1.35 Metiyonin en az 0.45 Sistin en az 0.35 Vit. A en az 15.000 IU/kg Vit. D en az 3.300 IU/kg Vit. E en az 40 mg/kg Vit.B2 en az 5 IU/kg Vit. B12 en az 20 mcg/kg Vit. K3 en az 5 mg/kg
Metabolik Enerji en az 3100 kcal/kg 3.2. Metot
Streptozotosin-diyabet oluşturmak amacıyla canlı ağırlıkları birbirine yakın 75 adet rata taze olarak çözündürülen STZ (Katalog no: S0130, Sigma-Aldrich Co.) (pH 4.5, 0.1 M sitrat buffer içinde) 60 mg/kg tek dozda intraperitonal (i.p) yolla verildi ve hayvanlar gözlem altına alındı. İki hafta sonra polifaji ile polidipsi görülen ve kan glukoz düzeyi 250
mg/dl’nin (GlukoDr, Allmedicus Co. Ltd., Kore) üstünde olan 42 adet rat çalışmada kullanılmak üzere seçildi ( Liu ve ark 2001, Cheng ve ark 2003, Bae ve ark 2005).
Sağlıklı ve STZ-diyabetiklerde kontrol ve deneme gruplarını oluşturmak için hayvanların kuyruk venasından alınan kan örnekleirnde glukoz düzeyleri belirlendi. Ortalama glukoz düzeyleri eşit olacak şekilde hayvanlar 6’şarlı gruplara ayrılarak numaralandırıldı.
Sağlıklı grup; Sağlıklı Kontrol (SK, n=18), Sağlıklı Deneme 1 (SD1, n=12) ve Sağlıklı Deneme 2 (SD2, n=12) gruplarına, SK grubu da 6’şarlı 3 gruba, SD1 ve SD2 grupları ise 6’şarlı 2 gruba ayrıldı.
Sağlıklı Kontrol (SK) grubunu oluşturan 18 ratın ilk 6’sından başlangıç değerlerini belirlemek amacıyla anestezi sonrası intrakardiak (i.c.) yolla kan örnekleri (1.5 ml) alındı. 12 adet rata ise, anestezi sonrası plasebo fizyolojik tuzlu su (FTS) (0.2 ml/200 g) i.p. yolla verildi, 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk’da i.c. yolla kan örnekleri alındı.
Sağlıklı Deneme 1 (SD1) grubunu oluşturan 12 rata 25 µg/kg β-endorfin (0.2 ml/200 g, FTS içinde) (Katalog: H-2814.0500, Bachem AG, İsviçre) (Matsumara ve ark 1984) i.p yolla (King ve ark 1979) verildi, 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk’da i.c. yolla kan örnekleri alındı. Sağlıklı Deneme 2 (SD2) 12 rata 50 µg/kg β-endorfin (0.2 ml/200 g, FTS içinde) i.p. yolla verildi, 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk’da i.c. yolla kan örnekleri alındı (Tablo 3.2).
STZ-Diyabetik grup; STZ-Diyabet kontrol (STZ-DK, n=18), STZ-Diyabet Deneme 1 (STZ-DD1, n=12) ve STZ-Diyabet Deneme 2 (STZ-DD2, n=12) gruplarına ayrıldı. STZ- DK grubu 6’şarlı 3 gruba, STZ-DD1 ve STZ- DD2 grubu ise 6’şarlı 2 gruba ayrıldı.
STZ-Diyabet kontrol (STZ-DK) grubunu oluşturan 18 ratın ilk 6’sından başlangıç değerlerini belirlemek amacıyla anestezi sonrası i.c. yolla kan örnekleri (1.5 ml) alındı. 12 adet rata ise anestezi sonrası plasebo FTS (0.2 ml/200 g) i.p. yolla verildi, 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk’da i.c. yolla kan örnekleri alındı.
STZ-Diyabet Deneme 1 (STZ-DD1) grubunu oluşturan 12 rata 25 µg/kg β- endorfin (0.2 ml/200 g, FTS içinde) i.p. yolla verildi ve 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk i.c. yolla kan örnekleri alındı. STZ-Diyabet Deneme 2 (STZ-DD2) grubunu oluşturan 12 rata 50 µg/kg β-endorfin (0.2 ml/200 g, FTS içinde) i.p. yolla verildi ve 6’sından 15., diğer 6’sından da 30. dk i.c. yolla kan örnekleri alındı (Tablo 3.2).
Tablo 3.2’de gruplar ve denek sayıları verilmiştir. Tablo 3.2. Gruplar ve denek sayıları
Gruplar 0. dk 15.dk 30. dk SK n=6 n=6 n=6 SD1 (25 µg/kg ß-end) - n=6 n=6 SD2 (50 µg/kg ß-end) - n=6 n=6 STZD- K grubu n=6 n=6 n=6 STZ-DD1 (25 µg/kg ß-end) - n=6 n=6 STZ-DD2 (50 µg/kg ß-end) - n=6 n=6 3.3. Örnekleme ve Analiz
Hayvanlar, insülin, glukoz (Cardoso ve ark 2005) ve ß-end (Helman ve ark 1983, Way ve ark 1984) düzeylerini etkilemeyen thiopental (40 mg/kg canlı ağırlık, Pental Sodium, İ.E. Ulagay İlaç San., İstanbul,Türkiye) ile anestezi edildi. Kan örnekleri glukozun alyuvarlar tarafından kullanımını engelleyen NaF (Merck) (1 mg/ml kan), EDTA (Merck) (1-2 mg/ml kan) ve proteaz inhibitörü aprotinin (500 KIU/ml, Katalog: A4529, Sigma-Aldrich Co.) bulunan polietilen tüplere alındı, +40 C’de 1600 g’de 15 dk santrifüj edilerek plazmaları ayrımlandı (Bright ve ark 1983, Guigliano ve ark 1992, Liu ve ark 1999a, Yamada ve ark 2002). Plazma glukoz düzeyleri glukoz oksidaz metoduna göre (Spinreact SA, Glucose LQ, İspanya) spektrofotometrik olarak belirlendi ve diğer ölçümler için plazmalar -800 C’de saklandı.
Plazma Glukoz Düzeyleri
Glukoz düzeyleri, spektrofotometrik olarak (UV 2100 UV-VIS Recording Spectrophotometer Shimadzu, Japonya) glukoz oksidaz metoduna göre çalışan Spinreact Glukoz kiti (İspanya) ile belirlendi.
Prensip:
Glukoz Oksidaz
β-D-glukoz +02 +H20 Glukonik asit + H202
FADH2 FAD
Peroksidaz
H202 + Fenol 4-AP (4-aminofenazon) Quinon + H20
Hesaplama:
(Örnek Absorbansı/Standart Absorbansı) x Standart Konsantrasyonu = mg/dl glukoz Plazma İnsülin Düzeyleri
Rat insülinine spesifik Linco RIA kiti (Research, Missouri, USA) ile plazma insülin düzeyleri belirlendi.
Prensip:
Hormon analizinde, işaretli hormon (tracer) (125I-insülin) spesifik antikoruna bağlanabilmek için işaretlenmemiş hormon ile yarışır. Antikora bağlı tracer oranı, ortamdaki hormon (plazmada veya standartta bulunan) miktarı ile ters orantılıdır. Antikora bağlanmamış tracerlar ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, antikora bağlı tracer miktarının gamma sayacında (Mini-Assay, tip: 6-20, Seri no: 01764, İngiltere) okunmasıyla örnekteki hormon miktarı belirlenir. Hormon miktarının hesaplanması aynı prensipten hareketle oluşturulan standart eğri aracılığı ile yapılır.
Kit İçeriği:
1- Assay Buffer: Fosfosalin (0.05 M, pH 7.4), EDTA (0.025 M), sodyum azid (% 0.08), bovine serum albumin (BSA, %1 RIA grade).
2- Antiserum: Assay buffer içinde kobay anti-rat serumu.
3- HPLC ile saflaştırılmış, 125I bağlı insülin (spesifik aktivite 367 µCi/ µg), liyofilize.
4- İşaretli hormonu hidrate edici buffer: Kobay IgG.
5- Standartlar: Standart buffer içinde saf rat insülini (0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 ng/ml).
6- Kalite kontrolleri: Assay buffer içinde saf rat insülini.
7- Presipitasyon reagent: Fosfosalin (0.05 M), EDTA (0.025 M) ve sodyum azid (% 0.08) içerisinde Keçi anti kobay-IgG serumu, PEG (%3) ve triton X-100 ( % 0.05).
Hesaplama:
Gamma sayacında NSB (non-spesifik bağlanma), Bo (Total Bağlanma), standart ve örnek cpm’leri belirlendi. Örnek ve standartlar çift örnek çalışıldı.
NSB, tüm değerlerden (Örnek, standart, Bo) çıkarıldıktan sonra ham değerler hesaplandı.
%B/Bo (% bağlanma) = (Örnek veya Standard / Bo) X 100
Yüzde (%) değerleriyle log/log grafik kağıdında çizilen standart eğrisinden örneklerdeki insülin düzeyleri belirlendi. Kitte metodun intra ve interassay katsayıları 0.5 ng/ml için sırasıyla %2.2 ve %8.9, kit hassasiyeti de 0.1-10 ng/ml olarak verilmektedir. Plazma Glukagon Düzeyleri
Pankreatik glukagona spesifik bir kit olan Linco (Research, Missouri, USA) ile plazma glukagon analizleri yapıldı.
Prensip:
Hormon analizinde, işaretli hormon (tracer) (125I-glukagon) spesifik antikoruna bağlanabilmek için işaretlenmemiş hormon ile yarışır. Antikora bağlı tracer oranı, ortamdaki hormon (plazmada veya standartta bulunan) miktarı ile ters orantılıdır. Antikora bağlanmamış tracerlar ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, antikora bağlı tracer miktarının gamma sayacında (Mini-Assay, tip: 6-20, Seri no: 01764, İngiltere) belirlenmesiyle örnekteki hormon miktarı hesaplanır. Hormon düzeylerinin hesaplanması aynı prensipten hareketle oluşturulan standart eğri aracılığı ile yapılır.
Kit İçeriği:
1- Assay Buffer: Glisin (0.2 M, pH 8.8), EDTA (0.03 M), sodyum azid (% 0.08), BSA (% 1, RIA grade).
3- HPLC ile saflaştırılmış 125I bağlı glukagon (spesifik aktivite 603 µCi/ µg), liyofilize.
4- İşaretli hormonu hidrate edici buffer: Glisin içeren assay buffer.
5- Assay buffer içinde standartlar: Saf rekombinant glukagon (20, 50, 100, 200, 400 pg/ml).
6- Kalite kontrolleri: Assay buffer içinde saflaştırılmış rekombinant glukagon. 7- Presipitasyon reagent: Fosfosalin (0.05 M), EDTA (0.025 M) ve sodyum azid
(0.08 %) içerisinde Keçi anti-kobay IgG serumu, PEG (%3) ve triton X-100 ( % 0.05).
Hesaplama:
Gamma sayacında NSB (non-spesifik bağlanma), Bo (Total Bağlanma), standart ve örnek cpm’leri belirlendi. Örnek ve standartlar çift örnek çalışıldı.
NSB, tüm değerlerden (Örnek, standart, Bo) çıkarıldıktan sonra ham değerler hesaplandı.
%B/Bo (% bağlanma) = (Örnek veya Standard / Bo) X 100
Yüzde (%) değerleriyle log/log grafik kağıdında çizilen standart eğrisinden örneklerdeki glukagon düzeyleri belirlendi. Kitte metodun, intra ve interassay katsayıları 60 pg/ml için sırasıyla % 6.8 ve % 13.5, kit hassasiyeti 20-400 pg/ml olarak verilmektedir. Plazma ß-endorfin Düzeyleri
Rat ß-end’nine spesifik olan Phoenix (Pharmaceuticals, Inc. Belmont, California) kiti kullanılarak plazma ß-end düzeyleri belirlendi.
Prensip:
Hormon analizinde, işaretli hormon (tracer) (125I-ß-end) spesifik antikoruna bağlanabilmek için işaretlenmemiş hormon ile yarışır. Antikora bağlı tracer oranı, ortamdaki hormon (plazmada veya standartta bulunan) miktarı ile ters orantılıdır. Antikora bağlanmamış tracerlar ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, antikora bağlı tracer miktarının gamma sayacında (Mini-Assay, tip: 6-20, Seri no: 01764, İngiltere) belirlenmesiyle
örnekteki hormon miktarı belirlenir. Hormon miktarının hesaplanması aynı prensipten hareketle oluşturulan standart eğri aracılığı ile yapılır.
Kit İçeriği:
1- RIA Buffer
2- Standart peptid: 12.8 µg/kg
3- Hormona spesifik tavşan antiserumu (liyofilize) 4- 125I-ß-end, 1.5 µCi (liyofilize)
5- Keçi anti tavşan IgG serumu (liyofilize) 6- Tavşan serumu
Hesaplama:
Gamma sayacında NSB (non-spesifik bağlanma), Bo (Total Bağlanma), standart ve örnek cpm’leri belirlendi. Örnek ve standartlar çift örnek çalışıldı. NSB, tüm değerlerden (Örnek, standart, Bo) çıkarıldıktan sonra ham değerler hesaplandı.
%B/Bo (% bağlanma) = (Örnek veya Standard / Bo) X 100
Yüzde (%) değerleriyle semi-log grafik kağıdında çizilen standart eğrisinden örneklerdeki ß-end düzeyleri belirlendi. Kit hassasiyeti 10-1280 pg/ml’dir.
3.4. İstatistik
Gruplar arasındaki farkları değerlendirmede ANOVA ve Duncan, diyabetik ve sağlıklılar arasındaki farkları değerlendirmede Student’s t-test kullanıldı. ß-end değerleri log 10’a çevrildikten sonra Duncan ve t-testleri uygulandı.
4. BULGULAR
STZ diyabetik kontrol gruplarında plazma glukoz ve glukagon düzeylerinin sağlıklı kontrol gruplarına göre belirgin olarak yükseldiği (p<0.001), insülin düzeylerinin ise düştüğü (p<0.001) tesbit edildiğinden ratlarda STZ uygulamasını takiben Deneysel Tip I diyabet modelinin oluştuğu kabul edildi (Tablo 4.1, Grafik 4.1).
Tablo 4.1. Sağlıklı (n=6) ve STZ diyabetik (n=6) kontrol gruplarında başlangıç kan parametreleri,
Parametre Sağlıklı _ ( X ± SH) STZ-diyabetik _ ( X ± SH) p ß-end (pg/ml) 48.17 ± 6.06 28.83 ± 3.27 * Glukoz (mg/dl) 108.83 ± 3.79 354.00 ± 23.85 *** İnsülin (ng/ml) 0.726 ± 0.021 0.237 ± 0.044 *** Glukagon (pg/ml) 27.67 ± 5.23 83.83 ± 5.75 *** *p<0.05, ***p<0.001
STZ uygulamasından 14 gün sonra rat canlı ağırlıklarının belirgin olarak (p<0.001) düştüğü (205.0 ± 10.7 - 163.0 ± 12.1 g) gözlendi. Sağlıklılarda ise canlı ağırlık yönünden önemli bir fark (161.17 ± 3.43 g - 164.50 ± 4.66 g) belirlenemedi (p>0.05).
Uygulamadan kaynaklanan stresin kan parametrelerine etkileri SK ve STZ-DK gruplarında farklılıklar göstermektedir (Tablo 4.2 - 4.3). SK gruplarında ß-end düzeyleri zamanla düşerken (p<0.05), STZ-DK’lerde ise bu düşme ancak 30. dk’da görüldü (p>0.05). Plazma glukoz ve insülin düzeyleri SK’larda zamanla azalırken, diyabetiklerde arttığı (p>0.05) belirlendi. Diğer yandan plazma glukagon düzeylerinin sağlıklılarda zamanla artarken, diyabetiklerde ise azaldığı (p>0.05) (Tablo 4.2 - 4.3) tespit edildi.
Kontrol ve deneme gruplarında i.p. ß-end uygulamalarının plazma ß-end, glukoz, insülin ve glukagon düzeylerine etkileri Tablo 4.2 ve 4.3’de verilmiştir.
Tablo 4.2. Sağlıklı ratlarda ß-end’in kan parametrelerine etkileri (her grup için, n=6)
SAĞLIKLI ß-end (pg/ml) Glukoz (mg/dl) İnsülin (ng/ml) Glukagon (pg/ml) _ (X ± SH) _ (X ± SH) _ (X ± SH) _ (X ± SH) SK 0.dk 48.17 ± 6.06 d 108.83± 3.79 a 0.726 ± 0.021 27.67 ± 5.23 ab SK 15. dk 10.30 ± 1.38 e 104.33 ± 4.55 ab 0.595 ± 0.079 30.67 ± 1.80 ab SK 30. dk 16.50 ± 4.15 e 97.30 ± 5.43 ab 0.572 ± 0.061 33.50 ± 3.21 ab SD1 15. dk 696.67 ± 119.68 b 106.83 ± 4.90 a 0.703 ± 0.054 28.00 ± 4.08 ab SD1 30. dk 357.50 ± 9.66 c 95.67 ± 4.12 ab 0.712 ± 0.042 39.17 ± 6.59 a SD2 15. dk 2000.00 ± 77.46 a 102.50 ± 3.78 ab 0.760 ± 0.013 25.83 ± 3.43 b SD2 30. dk 1750.00 ± 157.06 a 89.67 ± 1.98 b 0.640 ± 0.035 26.17 ± 0.87 ab p<0.05 p<0.05 p>0.05 p<0.05
a-e:Aynı sütunda bulunan farklı harfler istatistiki açıdan önemlidir.
Tablo 4.3. STZ-diyabetik ratlarda ß-end’in kan parametrelerine etkileri (her grup için, n=6)
STZ ß-end (pg/ml) Glukoz (mg/dl) İnsülin (ng/ml) Glukagon (pg/ml) _ (X ± SH) _ (X ± SH) _ (X ± SH) _ (X ± SH) STZ-DK 0.dk 28.83 ± 3.27 cd 354.00± 23.85 c 0.237± 0.044 83.83 ± 5.75 a STZ-DK 15. dk 37.33 ± 9.27 cd 395.83 ± 9.50 b 0.295 ± 0.056 76.00 ± 4.48 abc STZ-DK 30. dk 16.17 ± 2.33 d 427.83 ± 9.18 ab 0.295± 0.049 64.00 ± 4.09bc STZ-DD1 15. dk 280.00 ± 124.00 abc 416.60 ± 9.93 ab 0.238 ± 0.046 78.33 ± 4.54 ab STZ-DD1 30. dk 503.33 ± 201.19 ab 452.33 ± 13.28 a 0.205 ± 0.025 75.12 ± 6.40 abc STZ-DD2 15. dk 207.50 ± 126.72 bcd 422.67 ± 8.83 ab 0.346 ± 0.058 60.00 ± 6.20 c STZ-DD2 30. dk 758.50 ± 246.27 a 399.83 ± 8.65 b 0.285 ± 0.033 58.33 ± 7.82 c p<0.05 p<0.05 p>0.05 p<0.05
SD1 ve SD2 gruplarında ß-end uygulamasını takiben 15. dk ß-end düzeyleri doza bağlı olarak yükselirken, 30. dk’larda ise 15. dk’ya göre düşme gözlenmiştir (p<0.05) (Tablo 4.2, Grafik 4.2). STZ-DD1 ve DD2 gruplarında ise ß-end uygulamasını takiben 15. dk’da plazma ß-end düzeylerinin daha az oranda yükseldiği ve yükselmenin 30. dk’da da devam ettiği gözlenmiştir (p<0.05) (Tablo 4.3, Grafik 4.3).
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 15 30 Zaman (dk) Plazma ß -end pg/ml SK (Kontrol) SD1 (25 µg/kg) SD2 ( 50 µg/kg)
Grafik 4.2. Sağlıklılarda ß-end uygulamalarının plazma ß-end düzeylerine etkileri.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 15 30 Zaman (dk) P la zm a ß-e n d (p g/ m l) STZ-K (kontrol) STZ-DD1 (25 µg/kg) STZ-DD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.3. STZ-diyabetik ratlarda ß-end uygulamalarının plazma ß-end düzeylerine
Sağlıklılarda plazma glukoz düzeyleri normal sınırlar içerisinde olmakla beraber, SD2 grubunun 30. dk glukoz düzeyleri başlangıç düzeylerine göre düşmüştür (p<0.05) (Tablo 4.2, Grafik 4.4). STZ-diyabetiklerde ise STZ-DD2 grubu 30. dk glukoz düzeyleri STZ-DD1 grubu 30. dk’ya göre önemli düzeyde düşük (p<0.05) bulunmuştur (Tablo 4.3, Grafik 4.5). 80 85 90 95 100 105 110 115 120 0 15 30 Zaman (dk) P laz ma G lukoz m g /dl SK (Kontrol) SD1 (25 µg/kg) SD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.4. Sağlıklı ratlarda ß-end uygulamalarının plazma glukoz düzeylerine etkileri.
300 325 350 375 400 425 450 475 0 15 30 Zaman (dk) Pla zm a Gluk oz mg/dl STZ-K (Kontrol) STZ-DD1 (25 µg/kg) STZ-DD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.5. STZ-diyabetik ratlarda ß-end uygulamalarının plazma glukoz düzeylerine
SD1 ve SD2 gruplarında plazma insülin düzeyleri arasında istatistiki olarak önemli olmamakla beraber SK’ya göre yükselme gözlendi (p>0.05) (Tablo 4.2, Grafik 4.6). STZ- diyabetiklerde ise plazma insülin düzeyleri sağlıklılara göre oldukça düşük (p<0.001) bulundu (Tablo 4.1, Grafik 4.1) ve STZ-DD1 ve STZ-DD2 grupları arasında insülin düzeyleri yönünden bir fark (p>0.05) gözlenmedi (Tablo 4.3, Grafik 4.7).
0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0 15 30 Zaman (dk) Pla zma İ n s ül in ng/ ml SK ( Kontrol) SD1 (25 µg/kg) SD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.6. Sağlıklı ratlarda ß-end uygulamalarının plazma insülin düzeylerine etkileri.
0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 15 30 Zaman (dk) Pl azma İnsül in ng/ ml STZ-K (Kontrol) STZ-DD1 (25 µg/kg) STZ-DD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.7. STZ-diyabetik ratlarda ß-end uygulamalarının plazma insülin düzeylerine
Plazma glukagon düzeyleri sağlıklı gruplarda normal sınırlarda gözlenirken, STZ- diyabetiklerde ise belirgin olarak yüksek bulundu (p<0.001) (Tablo 4.1, Grafik 4.1). STZ- DD1 grubu 15. dk glukagon düzeylerinin, STZ-DD2 grubu 15. dk’ya göre önemli düzeyde yüksek olduğu belirlendi (p<0.05) (Tablo 4.2 - 4.3, Grafik 4.8 – 4.9).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 15 30 Zaman (dk) P laz m a G lu kag o n n g /m l SK (Kontrol) SD1 (25 µg/kg) SD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.8. Sağlıklı ratlarda ß-end uygulamalarının plazma glukagon düzeylerine etkileri.
40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0 15 30 Zaman (dk) Pl a zma Gl uk a g on pg/ m l STZ-K (kontrol) STZ-DD1 (25 µg/kg) STZ-DD2 (50 µg/kg)
Grafik 4.9. STZ-diyabetik ratlarda ß-end uygulamalarının plazma glukagon düzeylerine
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Öncelikli olarak hipofizde daha az oranda ise hipotalamus, adrenal medulla gibi dokularda sentezlenen, ağrı kesici etkinliğinin yanısıra birçok fizyolojik fonksiyonu da olan ß-end’in, reseptörlerinin bulunduğu pankreasla ilgili önemli fonksiyonlarının olabileceği ileri sürülmüştür (Watkins ve ark 1980, Khawaja ve ark 1990). Sunulan bu çalışmada, sağlıklı ve STZ-diyabetik ratlarda ß-end’in glukoz düzeylerine etkinliğinin araştırılması amacıyla iki farklı dozda i.p rat ß-end’i uygulanarak, plazma ß-end, glukoz, insülin ve glukagon düzeylerindeki değişimler izlendi.
Liu ve ark (1999a), soğuk stresi ve ß-end’in kan glukoz düzeylerine etkilerini araştırmak amacıyla yaptıkları çalışmada, sağlıklı ve STZ-diyabetik (i.v., 60 mg/kg dozda sitrat buffer içinde, uygulama sonrası 4 hafta sonra) Wistar ratlarda femoral ven ß-end düzeylerinin sırasıyla 43.2 pg/ml ve 49 pg/ml olduğunu, Forman ve ark (1985, 1986) ise STZ diyabetik ratlarda hipofiz ara lob, hipotalamus ve plazma ß-end düzeylerinin sağlıklılara göre düşük olduğunu (p<0.05), Locatelli ve ark (1986) da erkek STZ-diyabetik Sprague-Dawley ratlarda plazma ß-end düzeylerinin istatistiki önemi olmamakla birlikte sağlıklılara göre düşük olduğunu belirlemişlerdir.
Sunulan çalışmada, SK ve STZD-K grubu başlangıç ß-end düzeyleri (48.17 ± 6.06 - 28.83 ± 3.27 pg/ml) (Tablo 4.1, Grafik 4.1) Liu ve ark. (1999a)’nın sağlıklılarda bildirdikleri değerlerle uyumlu, STZ-diyabetiklerdekinden ise düşük olmakla birlikte Forman ve ark. (1985, 1986) ile Locatelli ve ark. (1986)’nın bildirdikleri değerlerle uyumlu bulundu.
Sato ve ark. (1987), sağlıklı Wistar-Kyoto ırkı ratlarda ß-end’in dolaşıma geçtikten sonra plazmada enzimatik parçalanmaya uğradığını ve kapillar damarlardan diffüze olarak dokular arası sıvıya geçtiğini, Hougten ve ark. (1980), Long Evans ırkı ratlarda ß-end’in plazma yarılanma süresinin yaklaşık 45 dk, Young ve ark. (1989) ise in vitro yaptıkları çalışmalarında ß-end’in EDTA’lı plazmada yarılanma süresinin 58 dk olduğunu bildirmektedirler. Strese bağlı olarak plazma ß-end düzeylerinin yükseldiği bildirilmektedir (Kelso ve ark 1984). Sunulan çalışmada, SK grubu 15. ve 30. dk’larında plazma ß-end düzeylerinin 0. dk’ya göre önemli düzeyde düştüğü belirlendi (p<0.05, Tablo 4.2). STZ- diyabetiklerde ise bu düşüş 30. dk’da görüldü (28.83 ± 3.27 - 16.17 ± 2.33 pg/ml) (p>0.05, Tablo 4.3). Bu durum, başlangıçta strese bağlı olarak artan ß-end’in zaman içerisinde düşmüş olabileceği şeklinde değerlendirilebilir.
Sağlıklı ratlarda i.v bolus ß-end uygulamasının plazma ß-end düzeylerine etkileriyle ilgili çalışmaya rastlanılamamış, ancak ratlarda ß-end infüzyonunun uygulamadan hemen sonra plazma ß-end düzeylerini yaklaşık 2.5 kat yükselttiği bildirilmiştir (Fatouros ve ark 1997). Sunulan çalışmada, 15. dk’da 696.67 ± 119.68 pg/ml olan SD1 plazma ß-end düzeylerinin 30. dk’da 357.50 ± 9.66 g/ml’ye (p<0.05), SD2 plazma ß-end düzeylerinin de 2000.00 ± 77.46 pg/ml’den 1750.00 ± 157.06 pg/ml’ye (p>0.05) düştüğü gözlendi (Tablo 4.2, Grafik 4.2). Bu durum, sağlıklılarda i.p ß-end emiliminin doz artışıyla ilgili olarak artması, buna karşın yıkılım oranının azalması şeklinde yorumlanabilirken, azalma sebebinin ß-end’in intraselüler sıvıya geçmesi ve proteazlar tarafından yıkımlanma kapasitesinin sınırlı olmasıyla açıklanabilir.
STZ-diyabetik ratlarda i.p ß-end emilimi ve kan düzeyleriyle ilgili çalışmaya rastlanılamamıştır. Ancak STZ diyabetik ratlarda bazı emilim ve dağılımların değiştiği, Vit D3 ve Ca’un bağırsaktan emilimlerinin azaldığı ve plasentadan yavruya Ca geçişinin bloke olduğu bildirilmiştir (Ohara 2000). Çalışmada STZ-DD1-2 gruplarında plazma ß-end düzeyleri doza bağlı olarak artmasına karşın, artış oranı SD1-2’ye göre oldukça düşük bulunmuştur. Buna ilaveten SD1-2’lerin ß-end düzeyleri 30. dk’da düşerken, STZ-DD1-2 gruplarında ise yükselme devam etmesine karşın düzeyler SD1-2’nin 30. dk düzeylerine ulaşamamaktadır (Grafik 4.2 - 4.3). STZ-DD1-2 15. dk ß-end düzeyleri, birbirine oldukça yakınken (280.00 ± 124 – 207.50 ± 126.72 pg/ml) 30. dk düzeyleri STZ-DD1 grubunda 503.33 ± 201.19, STZ-DD2 grubunda 758.50 ± 246.27 pg/ml olarak belirlendi. Sunulan çalışmada, STZ-diyabetik ratlarda i.p ß-end emiliminin sağlıklılara göre daha yavaş olması diyabetiklerde dehidrasyon, canlı ağırlık kaybı, doku hasarı ve/veya streptozotosinin etkilerinden kaynaklanabilir. STZ-DD1-2’lerde 30.dk ß-end düzeylerinin yine de SD1- 2’lerin 15. dk düzeylerine ulaşamaması, emilimin azalarak devam ettiğini, sağlıklılara göre yarılanma süresinin uzadığını gösterebilir (Grafik 4.2 – 4.3).
Sağlıklı erkek Sprague-Dawley ratlarda plazma glukoz düzeylerinin 116 ± 4 mg/dl (Locatelli ve ark 1986), 128 ± 5.4 mg/dl (6.8 ± 0.3 mM) (Sato ve ark 1996) olduğu bildirilmektedir. STZ-diyabetik ratlarda ise plazma glukoz düzeyleri sağlıklılara göre oldukça yüksektir. STZ-diyabetik Sprague-Dawley ratlarda (STZ - 60 mg/kg uygulamasından 5 gün sonra) dekapitasyonla alınan kan örneklerinde glukoz düzeylerinin 420 ± 40 mg/dl (Locatelli ve ark 1986), 8 haftalık erkek Wistar ratlarda (60 mg/kg STZ uygulamasını takiben 4 hafta sonra) pentobarbital anestezisi altında kuyruktan alınan kan örneklerinde 429 ± 4.4 mg/dl (Liu ve ark 1999b), 12-14 haftalık erkek Wistar-Kyoto
ratlarda (35 mg/kg STZ uygulamasından 2 gün sonra) 275.4 ± 14.4 mg/dl (15.3 ± 0.8 mM) olarak bildirilmektedir (Sato ve ark 1996). Sunulan çalışmada adı geçen araştırmacıların bulgularıyla uyumlu olarak SK grubu plazma glukoz düzeyleri 108.83 ± 3.79 mg/dl iken STZ grubununki 354.00 ± 23.85 mg/dl olarak belirlendi.
ß-end’in normal kan glukoz düzeylerine etkileriyle ilgili çalışmalarda; 8 haftalık erkek Wistar ratlarda ß-end gibi bir µ-agonisti olan loperamidin kan glukoz düzeylerini değiştirmediği (Liu ve ark 1999b), 20 haftalık erkek farelerde 1 mg/kg i.p. sentetik insan ß-end’i, plazma glukozunu önemli düzeyde değiştirmezken, uygulamanın ilk 15 dk’sında hafifçe düşürdüğü belirlenmiştir (Khawaja ve Green 1991). Sağlıklı bireylerde i.v. bolus ß-end’in doza bağlı olarak plazma glukoz düzeylerini yükselttiği (Guigliano ve ark 1987), ß-end infüzyonunun ise değiştirmediği (Guigliano ve ark 1992) bildirilmektedir. Sunulan çalışmada, SK plazma glukoz düzeylerinin referans aralıklarında olduğu, istatistiki önem göstermemekle birlikte SD1 ve SD2 gruplarında Khawaja ve ark (1990)’ın farelerde elde ettiği bulgularla uyumlu olarak ß-end’in her iki dozunda da plazma glukoz düzeylerinin çok az oranda düştüğü görüldü (Tablo 4.2, Grafik 4.4).
ß-end’in yüksek kan glukoz düzeylerine etkileriyle ilgili; Liu ve ark. (1999a), sham uygulaması yapmaksızın, 8-9 haftalık STZ-diyabetik (60 mg/kg, uygulamadan 4 hafta sonra) erkek Wistar ratlarda, 12.8 µg/kg dozda i.v. sentetik insan ß-end’in 15. ve 20. dk’larda plazma glukoz düzeylerini başlangıç glukoz düzeylerine göre önemli düzeyde düşürdüğünü (15.dk’da 475 mg/dl’den 430 mg/dl’ye, 20.dk’da 475 mg/dl’den 450 mg/dl’ye), 20. dk’dan itibaren tekrar başlangıç düzeylerine yükselttiğini bildirmektedirler. Aynı araştırıcılar (Liu ve ark 1999b) in vivo ve in vitro yaptıkları çalışmalarda, ß-end gibi bir µ-agonisti olan loperamidin (17.6 µg/kg, i.v) in vivo 30. dk plazma glukoz düzeylerini 425 mg/dl’den 370 mg/dl’ye düşürdüğünü (p<0.05), düşmenin in vitro STZ diyabetik soleus kasına glukoz girişinin önemli düzeyde artmasından (% 51 oranında) kaynaklandığını gözlemlemişlerdir. Serotoninin kan glukoz düzeylerine etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada (Chi ve ark 2007) 0.3 mg/kg i.p. serotoninin STZ-diyabetik (60 mg/kg) Wistar ratlarda, insülin düzeyleri değişmeksizin, plazma ß-end ve soleus kas glikojen düzeylerini artırdığı, plazma glukoz düzeylerini ise düşürdüğü (p<0.05), bu sebeple glukoz düzeylerindeki düşmenin insülinden bağımsız olarak ß-end’den kaynaklandığı bildirilmektedir. Sunulan çalışmada STZ grupları 15. dk glukoz düzeyleri her üçünde de yükselmesine karşın, STZ-DD2 grubunda 30. dk glukoz düzeyleri 15. dk düzeylerine göre azalmıştır (Grafik 5). Başlangıç glukoz düzeyleri 30. dk’daki STZD-K ve
STZ-DD2 ile karşılaştırıldığında, STZD-K glukoz düzeyi % 20.6 oranında artarken (354.00 – 427.83 mg/dl), STZ-DD2 grubunda ise % 12.7’lik bir artış (354.00 – 399. 83) gözlenmekle birlikte STZD-K grubundaki artış oranı dikkate alındığında STZ-DD2 grubundaki artışın % 7.9 oranında daha az olduğu görülmektedir. Grupların 15. dk ile 30. dk glukoz düzeyleri karşılaştırıldığında, STZ-DD2 30. dk glukoz düzeyleri 15. dk’ya göre (422.67 - 399.83 mg/dl) (Tablo 4.3, Grafik 5) % 5.4 oranında düştü, STZD-K grubundaki (395.83 – 427.83 mg/dl) % 8.08’lik artışla karşılaştırıldığında STZ-DD2 grubundaki düşüş anlamlı görülebilir.
ß-end’in etkileri, uygunlama yolu, kandaki konsantrasyonu, kan glukoz düzeyleri ve hayvan türlerine göre farklılık göstermektedir. Yetişkin, erkek Sprague-Dawley ratlarda intrasisternal (anestezisiz) 25.12 pg (7.25 nmol) ß-end’in, merkezi sempatik sistemi etkileyerek adrenal medulladan epinefrin salınımını kontrol ettiği ve plazma glukoz düzeylerini yükselttiği (p<0.05) (97.2 – 147.6 mg/dl) ileri sürülmektedir (Loon 1981). İnsanlarda ß-end’in insülin ve glukagon salınımına etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada (Guigliano ve ark 1987), i.v. 0.05 ve 0.5 mg dozlarda insan ß-end’i, plazma insülin ve