3. BULGULAR VE TARTIŞMA
3.1. Matematiksel Modelleme Etkinliklerinin Kullanıldığı Gruplarla Bu
Para a determinação da concentração dos herbicidas sulfentrazone e flumioxazin no solo, foram coletadas amostras aos 1, 31 e 53 dias após a segunda aplicação, sendo cada amostra composta constituída por 3 amostras simples. O equipamento utilizado na coleta das amostras de solo e a distribuição das amostras na coleta pontual pode ser observada na Figura 4. A primeira coleta foi realizada antes da ocorrência de chuvas. As coletas realizadas aos 31 e 53 dias após a aplicação dos herbicidas residuais foram realizadas após uma precipitação acumulada de 90 mm. Também realizou-se uma coleta para determinação da distribuição espacial dos herbicidas, aos 32 dias após a segunda aplicação, em um total de 20 amostras por tratamento, onde todas as amostras foram simples (Tabela 6). Após cada coleta as amostras foram homogeneizadas e armazenadas em sacos plásticos e mantidas congeladas em freezer (-20 °C) até o momento do preparo das amostras.
Figura 4. Trado empregado no processo de amostragem (A) e distribuição espacial da
coleta das amostras na coleta pontual em área sem (B) e com a presença de palha (C).
(A) (A)
As amostras foram armazenadas em freezer (-20° C) até o momento da extração e quantificação dos herbicidas. As análises laboratoriais foram realizadas no Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia (NUPAM) da Faculdade de Ciências Agronômicas, em Botucatu, São Paulo.
Tabela 6. Data, profundidade e número de pontos por parcela das coletas de solo.
Data Dias após a 2ª
aplicação Profundidade (cm) Pontos por parcela 1ª Coleta 08/12/2013 1 0 – 10 3 2ª Coleta 07/01/2014 31 10 – 20 0 – 10 20 – 40 3 3ª Coleta 08/01/2014 32 0 – 10 5 4ª Coleta 29/01/2014 53 0 – 10 10 – 20 20 – 40 3
Para a extração dos herbicidas, uma alíquota de 7 g de cada amostra de solo foi acondicionada em cartuchos plásticos com volume total de 10 mL, contendo uma pastilha porosa para retenção de partículas de solo, acoplados a um compartimento para a coleta da solução. Cada amostra foi saturada com 2,5 mL de água deionizada. Após saturados, os solos permaneceram em repouso durante 24 horas, sob refrigeração (8 ± 3 °C), conforme Figura 5. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas em centrífuga Hettich Zentrifugen a 3270 G, a 25°C por 10 minutos. Em seguida, coletando-se toda a solução presente no coletor. Esta solução foi filtrada em seringas plásticas de 3,0 mL equipadas com filtro Millipore e, posteriormente, transferidas para frascos do tipo “vials”, de 2,0 mL, os quais foram lacrados e armazenados em freezer a (-20 oC) até o momento da quantificação dos herbicidas por
cromatografia e espectrometria de massas (CARBONARI, 2009).
A quantificação do herbicida presente na solução coletada foi realizada por um sistema LC-MS/MS, o qual é composto por Cromatógrafo Líquido de Alta Perfomance (HPLC),da marca Shimadzu e modelo Prominence UFLC, sendo este equipado com duas bombas LC-20AD, injetor automático SIL-20AC, degazeificador DGU-20A5, controlador CBM-20ª e forno CTO-20AC. O HPLC está acoplado a um espectrômetro de massas 3200 Q TRAP da Applied Biosystems, do tipo triplo quádruplo,
constituído por coluna de C18, marca Synergi 2,5μ Hydro-RP 100Å, com dimensões de 50 x 4,6 mm e volume de injeção de 20μL (Figura 6).
Figura 5. Detalhe do processo de saturação e extração do herbicida contido na solução do
solo das amostras para quantificação dos compostos por cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massas.
As análises foram efetuadas utilizando o modo gradiente, apresentando como fases móveis os solventes metanol e água com ácido acético (pH 3,0). A partir das áreas dos picos e das concentrações de padrões dos herbicidas, foram determinados a equação linear de regressão, o coeficiente de correlação, o coeficiente determinação, o limite de detecção e o limite de quantificação do método (MEIER; ZÜND, 1993).
Figura 6. Cromatógrafo Líquido (Prominence UFLC) acoplado ao espectrômetro de
massas (3200 Q TRAP) – LC-MS/MS.
Para grupos de compostos similares, este método apresenta resultado uniforme e confiável, mantendo uma relação constante entre a intensidade de sinal (área do pico cromatográfico) e a concentração dos diferentes compostos, em unidades molares (CARBONARI, 2009).
As condições cromatográficas utilizadas para a quantificação dos herbicidas, no modo de ionização positivo, estão apresentadas na Tabela 7.
Tabela 7. Condições cromatográficas empregadas para quantificação dos herbicidas.
Coluna Analítica Synergi 2,5 μ - Hydro-RP 100 Å (50 x 4,60 mm) Fase Fase B metanol 0,5% ácido acético Fase A água 0,5% ácido acético
Gradiente
0 - 1 minuto: 70% Fase A e 30% Fase B 1 – 4 minutos: 5% Fase A e 95% Fase B 4 - 6 minutos: 5% Fase A e 95% Fase B 6 - 8 minutos: 70% Fase A e 30% Fase B 8 – 10 minutos: 70% Fase A e 30% Fase B
Fluxo 0,4 mL min-1
Na confecção das curvas, as equações obtiveram bom ajuste ao modelo linear para descrever a relação entre resposta do detector (y) e concentração do herbicida (x), tendo como coeficiente de correlação (r²) de 0,9953 para o sulfentrazone.A curva analítica dos herbicidas analisados pode ser representada pela equação da regressão linear: y = ax + b, onde, a é a inclinação da reta e b é a intersecção da curva analítica.
As curvas analíticas e as faixas de concentração para cada herbicida analisado estão representadas na Tabela 8.
Tabela 8. Curvas analíticas e faixas de concentração para os herbicidas analisados. Analitos Equação da reta Dados de calibração r2 Intervalo linear (μg L-1)
flumioxazin y = 41,7 x + 440 0,9915 1,5625 a 100 sulfentrazone y = 664 x + 533 0,9953 1,5625 a 500
Para a identificação exata de um composto torna-se necessário o monitoramento de mais do que um fragmento molecular bem como as transições iônicas oriundas da fragmentação de cada analito. Desta forma, garante-se sensibilidade e especificidade necessárias para a quantificação de cada composto (QUEIROGA, 2014). A massa molecular e os fragmentos gerados a partir de cada molécula estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Massa molecular e íons secundários dos herbicidas analisados.
Composto Massa Molecular Íons Secundários (Fragmentos)
flumioxazin 355,055 176,1 77,1 79,1 sulfentrazone 386,950 110,2 146,1 273,1
A detecção do sulfentrazone pode ser observada na Figura 7, através das áreas de picos representadas no cromatograma dos padrões analíticos. O tempo de retenção do sulfentrazone na coluna cromatográfica foi de 4,96 minutos.
Figura 7. Cromatograma do sulfentrazone com seus respectivos fragmentos na
concentração de 50 μg L-1.