Marka Sadakati Türleri

Segundo Chandramouli & Qian (2009), a proteómica é o estudo em larga escala da estrutura e função das proteínas presentes numa amostra biológica complexa. (Chandramouli & Qian, 2009). Atualmente, esta ferramenta é utlizada para o diagnóstico de algumas doenças, através de diferentes tecidos e fluidos corporais tais como a saliva, o fluido lacrimal e o sangue. (Barbosa et al., 2012) A proteómica tem revelado ser uma metodologia preponderante, uma vez que esta revela informações importantes acerca do estado de saúde do organismo em geral, assim como é importante na área da pesquisa e desenvolvimento de fármacos.

Enquanto a genómica, termo utilizado desde 1986, inclui o genoma completo da célula, a proteómica, conhecida em 1997, utiliza os produtos dos genes inteiros de uma célula num determinado estado que abrange as suas atividades celulares e a interação com outras macromoléculas. (Humphery-Smith, 2004) Desta forma, a proteómica permite a análise das proteínas quanto a sua qualidade e quantidade. A análise proteómica revela ser mais vantajosa em relação à genómica uma vez que permite um melhor conhecimento do organismo. (Gupta et al., 2015)

Para uma correta análise do proteoma é importante a extração correta das proteínas e esta. varia consoante o tipo e origem da amostra biológica. Segundo Barbosa, et al (2012) a maioria das amostras biológicas devem ser solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e submetidas a tratamento com agente redutores de pontes dissulfito.

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A análise proteómica pode ser feita por metodologias diferentes como demonstra a figura 7.

Figura 7: Metodologias diferentes que podem ser combinadas na Análise Proteómica (Barbosa

et al., 2012)

Grande parte das técnicas proteómicas têm como base a identificação de biomarcadores, mas cingem-se a aplicações médicas diretas. Outras podem ser utilizadas em prática clínica de rotina para diagnósticos e tem por base as alterações no proteoma, através da análise de diferentes tecidos e fluidos corporais como amostras biológicas. (Barbosa et al., 2012)

Segundo Armorotti (2010), as metodologias podem ser classificadas em dois tipos: Bottom-up ou shotgun e top-down.

Na Bottom-up ou shotgun recorre-se à cromatografia líquida para separar os péptidos de uma solução complexa e, posteriormente, realiza-se a espectrometria de massa (MS) para análise dos mesmos. É uma metodologia vantajosa no que se refere a sensibilidade e reprodutibilidade, contudo alguns péptidos perdem-se durante a cromatografia e noutros não é possível reconhecer as alterações pós-transducionais.

No caso da metodologia top-down recorre-se à MS para análise das proteínas na sua forma complexa, sendo esta uma vantagem em relação à metodologia anterior, na medida em que não são analisados os fragmentos e não há perdas de péptidos, obtendo- se, assim, uma análise mais completa dos constituintes proteicos. (Armirotti & Damonte, 2010)

CAPÍTULO III – A Saliva e a Análise Proteómica

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Outra metodologia utilizada para a separação de proteínas é através de eletroforese uni (1-DE) e bidimensional (2-DE). A eletroforese bidimensional envolve a separação de proteínas em duas etapas seguidas. Na primeira, a focalização isoelétrica, há migração das moléculas em gel de poliacrilamida com gradiente de pH imobilizado ou gerado por tampões anfotéricos até atingirem um ponto no qual a sua carga é igual a zero. Na segunda, as proteínas são separadas de acordo com a sua massa molecular através uma eletroforese com direção perpendicular à primeira em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Esta segunda etapa é idêntica à eletroforese 1-D em que as proteínas são separadas de acordo com a massa molecular através de uma corrida em gel SDS-PAGE. (Barbosa et al., 2012)

Esta metodologia, utilizando a eletroforese, permite obter muitas informações importantes, contudo ainda apresenta algumas limitações, tais como: a utilização de alguns fluidos corporais com proteínas em concentrações abundantes dificulta a migração destas por eletroforese, por outro lado para as proteínas serem analisadas por top-down é necessário que estas estejam intactas o que é difícil uma vez que têm de ser extraídas do gel. (Armirotti and Damonte, 2010)

Existem ainda outras abordagens, como o caso dos vários tipos de cromatografias, que permitem melhorar a separação das proteínas e dos péptidos. Numa das metodologias aplicadas há dissolução do analito numa fase líquida com a qual não tem qualquer interação química e este percorre uma fase estacionária, denominando-se esta por cromatografia líquida (LC). (May et al., 2011)

Após a separação das proteínas e dos péptidos caracterizadores do proteoma salivar é necessário a sua identificação e esta pode ser realizada por espectrometria de MS. (Han, Aslanian, & Yates, 2008)

A MS utiliza um aparelho denominado espetrómeto e permite a identificação e quantificação de proteínas. Esta metodologia é muito utilizada em proteómica e permite avaliar essencialmente o rácio massa/carga (m/z) de iões em fase gasosa. (Wilhelm et al., 2014) A ionização por eletrospay (ESI – Electrospray Ionization) e a dessorção/ionização com laser assistido por matriz (MALDI – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) são duas técnicas que permitem a ionização de péptidos e proteínas de forma a, posteriormente, poderem ser utilizadas em MS. (Han et al., 2008)(Barbosa et al., 2012)

A primeira (ESI) é utilizada em amostras no estado líquido, já a MALDI é utilizada em amostras no estado sólido. Existem duas variantes à metodologia MALDI: numa das variantes há melhoria da superfície por dessorção/ionização com laser (SELDI

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– Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) e é utilizada para analisar proteomas de baixo peso molecular; a outra variante permite a obtenção das massas de péptidos e proteínas a partir de amostras de seções de tecidos biológicos e é denominada de espetrometria de massa de imagem (IMS – Imaging Mass Spectrometry). Esta última apresenta algumas vantagens como é o caso da rapidez e a independência do uso de anticorpos (Gustafsson, Oehler, Ruszkiewicz, McColl, & Hoffmann, 2011)

A pesquisa nesta área da análise proteómica deve continuar a ser desenvolvida, de forma a melhorar as tecnologias utilizadas nesta área, aumentando a sua especificidade e sensibilidade para a identificação de proteínas que se encontrem relacionadas com estados de doença humana específica, com o objetivo final de diagnosticar e monitorizar uma doença com precisão. (A. Zhang et al., 2013)