MALDI-ToF Sonuçları

Yapılan deneyler sonucunda elde edilen THP-1 insan monosit hücrelerinin membran proteinlerine ait MALDI-MS kütle spektrumunda, 11374.74, 13998.42, 15341.98 ve 17878.29 m/z değerlerinde yüksek şiddetli sinyaller gözlenmiştir (Şekil 4.56.A).

LDL ile etkileştirilen THP-1 insan monosit hücrelerinin kütle spektrumunda ise 11303.78, 13996.33, 15326.97, 17876.40 m/z değerlerinde yüksek şiddetli sinyaller gözlenmiştir (Şekil 4.56.B). Aynı proteinler, THP-1 insan monosit hücrelerine ait kütle spektrumunda da gözlenmektedir. Ancak bu örneğin kütle spektrumunda gözlenen sinyallerin şiddetlerinde artış olduğu tespit edilmiştir.

Bunların yanı sıra 8564.58 m/z sinyali, THP-1 insan monosit hücrelerin kütle spektrumunda gözlenmeyip, sadece LDL ile etkileştirilen monosit hücrelerin spektrumunda gözlenmektedir. Bu farklılığın LDL’nin THP-1 monosit hücrelerinin yapısında meydana gelen değişikliklerden kaynaklandığı düşünülmektedir.

Okside-LDL ile etkileştirilmiş THP-1 monosit hücrelerinin kütle spektrumu, THP-1 ve LDL ile etkileştirilen THP-1 insan monosit hücrelerinin kütle spektrumları ile karşılaştırıldığında bu spektrumda diğerlerinden farklı m/z değerlerinde sinyaller gözlendiği belirlenmiştir. Elde edilen kütle spektrumunda diğerlerinden farklı olarak 7574.82, 9082.89, 14611.40 m/z değerlerinde sinyaller gözlenmektedir (Şekil 4.56.C). Bunun yanı sıra üç farklı örneğe ait kütle spektrumlarında aynı proteinlere ait sinyaller gözlenmiştir. Bu bulgular ışığında okside-LDL ile etkileştirilen THP-1 monosit hücrelerinin yapısal farklılıklar gösterdiği düşünülmektedir. Bu durum, LDL ve okside-LDL ile etkileştirilen THP-1 insan monosit hücrelerinin membran yüzeylerinde farklı türlerin oluştuğunun veya türlerin değişikliğe uğradığının bir göstergesidir.

135

Şekil 4.56. Membran proteinlerinin MALDI-MS spektrumları. (A) THP-1 insan monosit hücresi, (B) LDL ile etkileştirilmiş THP-1 insan monosit hücresi ve (C)

okside-LDL ile etkileştirilmiş THP-1 insan monosit hücresi.

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

0 1.7E+4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% Intensity VoyagerSpec #1[BP =2247.7,28987]

11344.74

13998.42

15314.98

17876.29

A

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

8632.5

10 20 30 40 50

% Intensity VoyagerSpec#1=>NF0.7[BP= 2299.5, 31003]

11303.78

13996.33

15326.97 17874.40

B

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

0 1.9E+4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% Intensity Voyager Spec#1[BP= 2285.7, 37272]

7574.82

9082.89 11300.13

13995.65 14611.40

17868.48

C

8564.58

136

Makrofaj hücrelerinin membran proteinlerine ait MALDI-MS kütle spektrumunda (Şekil 4.56), 11294.85, 13998.32, 15316.51 ve 17866.10 m/z değerlerinde yüksek şiddetli sinyaller gözlenmektedir (Şekil 4.57.A).

LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarına ait kütle spektrumunda ise 11297.17, 13995.11, 15322.58, m/z değerlerinde yüksek şiddetli sinyaller gözlenmiştir (Şekil 4.57.B). Söz konusu sinyaller, makrofaj hücre membranına ait kütle spektrumunda da gözlenmektedir. Ancak bu sinyaller, her iki örneğe ait kütle spektrumlarında yaklaşık olarak aynı m/z değerlerinde elde edilse de, LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarına ait kütle spektrumunda sinyal şiddetlerinin daha yüksek olduğu görülmektedir. LDL etkileşiminden sonra, makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarına ait kütle spektrumunda 17866.10 m/z değerlerinde gözlenmekte olan sinyalin kaybolduğu tespit edilmiştir.

Okside-LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarının kütle spektrumu, makrofaj ve LDL ile etkileştirilen makrofaj örneklerinin kütle spektrumlarından tamamen farklılık göstermektedir. Okside-LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarına ait kütle spektrumunda özellikle düşük molekül aralığı bölgesinde yüksek şiddetli sinyaller gözlenmiştir. Bu spektrumda 7200.10, 7576.60, 9084.66, 10261.09, 12357.58, 14031.03 m/z değerlerindeki sinyaller bulunmaktadır (Şekil 4.57.C). Makrofaj ve LDL ile etkileştirilen makrofaj örneklerine ait kütle spektrumlarında ortak olarak gözlenen sinyallerin okside-LDL ile etkileştirilen örneğe ait kütle spektrumunda bulunmadığı gözlenmiştir. Tez çalışmasının köpük hücre oluşumu ile ilgili bölümünde makrofaj hücrelerinin okside-LDL partiküllerini içerisine almasıyla köpük hücrelerinin oluştuğu gösterilmiştir. MALDI-MS sistemi ile gerçekleştirilen analizler sonucunda elde edilen veriler değerlendirildiğinde okside-LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin yapılarında değişikliklerin meydana geldiği ifade edilebilmektedir. Bu sonuçlar, oluşan köpük hücre yapılarının makrofaj hücrelerinden farklı olduklarının bir göstergesi olarak kabul edilebilir.

THP-1 monosit hücre membranı ve makrofaj hücre membranına ait kütle spektrumları karşılaştırıldığında ise THP-1 monosit hücrelerine ait kütle spektrumunda elde edilen sinyallerin sinyal/gürültü oranının daha düşük olduğu gözlenmektedir. Ayrıca her iki kütle spektrumunda yaklaşık aynı m/z değerlerinde

137

sinyaller elde edilmiştir. Makrofaj hücre membranına ait kütle spektrumunda sinyallerin şiddetlerinin düşük olduğu gözlenmektedir. MALDI-MS sistemi ile elde edilen veriler, THP-1 hücrelerinin PMA ile etkileştirilmeleri sonucunda makrofaj hücrelerine farklılaştıklarını göstermektedir. Elde edilen bu sonuçlarla birlikte yapıya uygulanan bu işlemin yapıda az da olsa farklılıklara neden olduğu düşünülmektedir.

LDL ile etkileştirilen THP-1 monosit hücrelerinin membranları ve LDL ile etkileştirilen makrofaj hücre membranlarına ait kütle spektrumları karşılaştırıldığında her iki kütle spektrumunda elde edilen sinyallerin m/z değerlerinde farklılık gözlenmemektedir. LDL ile etkileştirilen THP-1 monosit hücrelerinin membranlarına ait spektrumunda gözlenen 8564.58 m/z sinyalinin LDL-makrofaj örneğine ait kütle spektrumunda gözlenmediği belirlenmiştir.

Okside-LDL ile etkileştirilen THP-1 monosit ve makrofaj membranlarının kütle spektrumlarında aynı m/z değerlerinde sinyaller gözlense de, okside-LDL ile etkileştirilen makrofaj membranı örneğine ait kütle spektrumundaki sinyallerin şiddetlerinin daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. MALDI-MS sistemi ile elde edilen veriler değerlendirildiğinde okside-LDL ile etkileştirilen makrofaj hücrelerinin izole edilen membranlarının kütle spektrumunun diğer tüm örnek gruplarının spektrumlarına göre farklılık gösterdiği belirlenmiştir.

138

Şekil 4.57. Membran proteinlerinin MALDI-MS spektrumları. (A) Makrofaj hücresi,

(B) LDL ile etkileştirilmiş Makrofaj hücresi ve (C) okside-LDL ile etkileştirilmiş Makrofaj hücresi.

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

0 1.2E+4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% Intensity

11294.85

13988.32

15316.51

17866.10

A

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

0 8549.1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% Intensity

Voyager Spec#1[BP= 2212.4,13409]

11297.17

13995.11

15322.58

B

5000 9000 13000 17000 21000 25000

Mass (m/z)

0 1.3E+4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% Intensity

VoyagerSpec#1[BP =9085.0,13258]

7200.10 7576.80

9084.66

10261.09

12357.58 14031.03

C

139

Ouedraogo ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada, IFN-γ and IL-4 sitokinleri kullanılarak makrofaj hücreleri 18 saat süre ile stimüle edilmiştir. Söz konusu indükleyici ajanlar ile M1 ve M2 makrofaj kutuplaşması, MALDI-ToF-MS sistemi kullanılarak 2-12 KDa aralığında elde edilen kütle spektrumlarıyla belirlenmiştir. Bu çalışmada uyarılmamış ve uyarılmış makrofajların kütle spektrumlarının birbirlerinden tamamıyla farklı oldukları belirtilmiştir. Tez çalışmasında elde edilen LDL ve okside-LDL’ye maruz bırakılan monosit ve makrofaj hücrelerine ait kütle spektrumlarının söz konusu çalışmanın sonuçları ile uyumluluk gösterdiği görülmektedir [190].

MALDI-ToF-MS sistemi, tüm hücre örneklerindeki bakteri türlerinin tespit edilmesi çalışmalarında kullanılmaktadır. Son yıllarda yapılan proteomiks uygulamalarında da iki boyutlu elektroforetik sistemlerle beraber kullanılmaktadır. Slomianny ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada, monosit ve makrofaj hücreleri kullanılmıştır.

Bu çalışmada monosit ve makrofaj hücrelerinin membran izolasyonu için deterjan ağırlıklı izolasyon yöntemi uygulanmıştır. Bu nedenle membran izolasyon basamağından sonra MALDI-ToF-MS analizleri sırasında karşılaşılacak olumsuz etkilerin önlenmesi amacıyla çeşitli saflaştırma işlemleri uygulanarak membran içindeki fazla deterjan yapıları uzaklaştırılmaya çalışılmıştır. Yapılan iki boyutlu elektroforez işleminden sonra yürütülen jeller kesilerek kesitlerde bulunan proteinler jel içerisinde enzimatik olarak parçalanmıştır. Enzimatik parçalama işlemi sonrasında elde edilen peptit birimleri, MALDI-ToF-MS sistemiyle tayin edilerek insan makrofajlarının membran proteinlerinin profilleri belirlenmiştir [191].