Na Figura 28 verifica-se que o (-)- -bisabolol não alterou a constante de tempo de repolarização quando o nervo isquiático foi incubado nas concentrações de 0,5 mM, 1 mM, 5 mM e 10 mM. Controle 10 20 30 10 20 30 40 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Lavagem (-)-αααα-bis (0,5 mM) ττττ ( m s ) Controle 10 20 30 10 20 30 40 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Lavagem (-)-αααα-bis (1 mM) Controle 10 20 30 10 20 30 40 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Lavagem (-)-αααα-bis (5 mM) Tempo (min) ττττ ( m s ) Controle 10 20 30 10 20 30 40 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Lavagem (-)-αααα-bis (10 mM) Tempo (min)
Figura 28. Constante de tempo de repolarização ( ) durante a incubação com (-)- - bisabolol. Valores da constante de tempo de repolarização quando o nervo isquiático era
incubado com (-)- -bisabolol – (-)- -bis – nas concentrações de 0,5 mM (A), 1 mM (B), 5 mM (C) e 10 mM (D) durante 30 minutos, seguidos de 40 minutos de lavagem com solução fisiológica. Os resultados são mostrados como a média ± EPM. (n=3 para 0,5 mM; n=4 para 1,0 e 5,0 mM e n=8 para 10 mM). (Teste-t de student pareado).
5 DISCUSSÃO
Nos últimos anos tem sido evidenciado que os produtos naturais representam uma valiosa fonte para novos compostos com potencial aplicação tanto no desenvolvimento de novas terapias, como na pesquisa em torno dos mecanismos subjacentes aos processos fisiológicos e fisiopatológicos da dor. Além disso, o conhecimento da estrutura e da atividade biológica das moléculas derivadas de produtos naturais é fundamental no desenvolvimento de novas moléculas analgésicas, sintéticas ou semi-sintéticas, com um perfil farmacológico adequado (ALMEIDA et al., 2006; EDRIS, 2007; McCURDY; SCULLY, 2005; MOMIN; WOOD, 2008).
Atualmente, há uma vasta literatura científica demonstrando que o efeito antinociceptivo de óleos essenciais extraídos de várias plantas pode estar relacionado aos compostos terpênicos presentes nesses óleos (ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; CALIXTO et al., 2000; DE SOUSA et al., 2007; HEJAZIAN, 2006; SANTOS et al., 2005). Estudos anteriores relataram que o extrato da camomila (Matricaria recutita L.) e o óleo essencial da Achillea aleppica DC. subsp. aleppica, contendo (-)- -bisabolol e outros derivados terpênicos, apresentaram significativa atividade antinociceptiva e anti-inflamatória em camundongos (HEJAZIAN, 2006; ISCAN et al., 2006; KESMATI; BARFINEJAD; MOGHADAM, 2007). Entretanto, não foram encontrados relatos na literatura respeito de um efeito antinociceptivo do (-)- -bisabolol. Assim, o presente trabalho se propôs a estudá-lo utilizando modelos experimentais in vivo e ex vivo..
As investigações sobre um possível efeito antinociceptivo do (-)- -bisabolol revelaram que esse composto pode ser bastante interessante do ponto de vista do estudo de substâncias analgésicas. O presente estudo ainda contribui para a compreensão do perfil farmacológico dos óleos essenciais obtidos de algumas espécies vegetais, especialmente o óleo essencial da camomila, no qual o (-)- -bisabolol atua como um dos principais componentes ativos (DARRA et al., 2008; LAHIJANI et al., 2006).
Inicialmente, durante a triagem farmacológica comportamental, foi observado que o (-)- -bisabolol produziu em camundongos indícios de efeito analgésico, mesmo quando tratados com a dose de 25 mg/kg (Tabela 1). Outras alterações comportamentais foram produzidas nos camundongos tratados com a dose de 100 mg/kg de (-)- -bisabolol, tais como perda de reflexo auricular e corneal, resposta ao toque diminuída, sedação e ptose palpebral, indicando um perfil compatível com o de substâncias depressoras do SNC (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). De fato, a possibilidade do (-)- -bisabolol causar os efeitos observados
por meio da interação farmacológica em nível central é válida, visto que já é comprovada a permeabilidade desse composto à barreira hematoencefálica (CAVALIERI et al., 2004). Em estudo farmacocinético foi relatado que 24 horas após a administração de 120 mg/kg de (-)-
-bisabolol em ratos, os animais apresentavam uma concentração desse composto de pelo menos 50 M no cérebro (CAVALIERI et al., 2004). Além do mais, a dose letal mediana em camundongos foi de 13 a 14 g/kg por administração oral e 633 mg/kg por administração intraperitoneal. Assim, devido à sua baixa toxicidade pode-se explicar a ampla utilização desse composto em preparações cosméticas (BHATIA et al., 2008). Também verificamos diminuição dos bolos fecais e da micção nos camundongos tratados com (-)- -bisabolol em todas as doses (Tabela 1), corroborando com a indicação de uma possível interação do composto testado com o sistema nervoso autônomo (ALMEIDA et al., 1999).
No presente estudo, verificamos que o (-)- -bisabolol apresentou diminuição da resposta nociceptiva em dois modelos comportamentais para analgesia: o teste das contorções abdominais induzidas pela administração intraperitoneal de ácido acético e o teste da formalina. O último, considerado um teste que se assemelha de forma mais aproximada à dor clínica em comparação com outros testes que empregam estimulação mecânica ou térmica (CAMPOS et al., 2002; TJOLSEN et al., 1992).
O teste do ácido acético é um método não-específico para avaliação do efeito antinociceptivo, visto que é utilizado para avaliar a atividade analgésica tanto em nível central como periférico. Contudo, esse teste é simples e rápido, útil para a investigação preliminar do efeito antinociceptivo de uma determinada substância (AMARAL et al., 2007; GONÇALVES et al., 2008; KOSTER et al., 1959; SANTOS et al., 2005; VALÉRIO et al., 2007). O teste do ácido acético envolve a estimulação direta das fibras aferentes nociceptivas por induzir a liberação de mediadores inflamatórios, bem como pela redução do pH na cavidade peritoneal. A diminuição na frequência do comportamento de contorções abdominais e extensão das patas posteriores dos camundongos administrados previamente com um determinado composto pode estar relacionada a um efeito antinociceptivo desse composto (AMARAL et al., 2007; FRANÇA et al., 2001; KOSTER et al., 1959).
A administração prévia de (-)- -bisabolol provocou redução significativa das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, sendo observado um efeito semelhante na diminuição das contorções nos grupos tratados com (-)- -bisabolol 50 mg/kg e morfina 6 mg/kg (Figura 11). Esses resultados indicam uma provável atividade antinociceptiva do (-)- -bisabolol que poderia estar sendo causada pelo bloqueio dos mecanismos periféricos e/ou centrais de neurotransmissão, bem como pela supressão da
síntese e/ou da liberação das substâncias mediadoras do processo inflamatório (AMARAL et al., 2007; KOSTER et al., 1959). De fato, existem na literatura estudos relatando um efeito semelhante na diminuição das contorções abdominais induzidas por acido acético em animais tratados com compostos terpenóides como o (+)-limoneno e a (-)-carvona (AMARAL et al., 2007; GONÇALVES et al., 2008).
A fim de caracterizar melhor a resposta antinociceptiva observada, foi realizado o teste da formalina, um teste comportamental mais específico e que melhor indica a possibilidade de uma interferência da substância estudada nos mecanismos de neurotransmissão e/ou sobre o processo inflamatório (AMARAL et al., 2007; GONÇALVES et al., 2008; HUNSKAAR; HOLE, 1987). O teste da formalina consiste de um modelo para a avaliação da resposta nociceptiva durante duas fases que são caracterizadas por mecanismos distintos de geração do estímulo nociceptivo (HUNSKAAR; HOLE, 1987). A resposta nociceptiva gerada na primeira fase envolve a estimulação direta dos terminais aferentes nociceptivos mielinizados e não-mielinizados causada pela administração subplantar de formalina. Tem sido relatado que a liberação de bradicinina e substância P está envolvida na geração do estímulo nociceptivo durante esta fase (AMARAL et al., 2007). Também tem sido verificado que a resposta nociceptiva pode ser suprimida na primeira fase, principalmente pela administração de analgésicos de ação central como a morfina (AMARAL et al., 2007; BITTENCOURT; TAKAHASHI, 1997; GONÇALVES et al., 2008). Já a segunda fase é caracterizada pela ação de mediadores inflamatórios liberados no local da lesão que causam redução do limiar excitatório dos neurônios aferentes nociceptivos, como histamina, bradicinina, serotonina, aminoácidos e prostaglandinas (AMARAL et al., 2007; GONÇALVES et al., 2008; HUNSKAAR; HOLE, 1987). Nesta fase, podem estar relacionadas também as mudanças funcionais nos neurônios espinhais envolvidos na facilitação da transmissão sináptica em nível central. Desse modo, a resposta nociceptiva pode ser suprimida na segunda fase do teste da formalina pela administração da maioria dos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES), como o AAS, o naproxeno e a indometacina (AMARAL et al., 2007; TJOLSEN et al., 1992; YASHPAL; CODERRE, 1998).
O (-)- -bisabolol reduziu o tempo total de lambida da pata nos camundongos tanto na primeira como na segunda fase do teste da formalina, de forma semelhante ao grupo tratado com morfina (Figuras 12 e 13). No caso do efeito analgésico causado pela morfina ocorre a ativação do sistema opióide endógeno (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998; McNALLY, 1999; MILLAN, 1999), o que pode estar relacionado, pelo menos em parte, ao efeito causado pelo (-)- -bisabolol. Porém, existe a necessidade de testes adicionais para comprovar essa
hipótese. Além disso, há a possibilidade do (-)- -bisabolol estar atuando por inibir os mecanismos envolvidos na geração e transmissão do estímulo nociceptivo na primeira fase (AMARAL et al., 2007; TJOLSEN et al., 1992). Entretanto, na segunda fase do teste da formalina foi observado efeito significativo do (-)- -bisabolol na concentração de 25 mg/kg, o que não aconteceu na primeira fase (Figura 13). Esse resultado sugere um possível efeito do (-)- -bisabolol sobre os mecanismos de sensibilização periférica decorrentes do processo inflamatório, e/ou um efeito sobre mecanismos de sensibilização central (AMARAL et al., 2007; TJOLSEN et al., 1992; YASHPAL; CODERRE, 1998). Como esperado, a diminuição do tempo de lambida da pata na segunda fase do teste da formalina foi observada também no grupo-padrão tratado com AAS, um inibidor das enzimas COX-1 e COX-2 (GONÇALVES et al., 2008; McCURDY; SCULLY, 2005; WOOLF, 2004). Já é bem estabelecido que o AAS reduz a resposta nociceptiva por suprimir a síntese e/ou liberação dos eicosanóides (McCLESKEY; GOLD, 1999; McCURDY; SCULLY, 2005; WOOLF, 2004).
Em 2007, Amaral et al., demonstraram que a atividade antinociceptiva do R-(+)- limoneno estaria predominantemente relacionada com a supressão da síntese ou ação de mediadores inflamatórios. Esta demonstração foi baseada principalmente nos resultados significativos obtidos na segunda fase do teste da formalina, onde o R-(+)-limoneno causou redução da resposta nociceptiva nas doses de 25 mg/kg e 50 mg/kg. De um modo semelhante ao R-(+)-limoneno, o (-)- -bisabolol foi eficaz nas mesmas doses na segunda fase do teste da formalina. Portanto, há a possibilidade do (-)- -bisabolol estar atuando de uma forma parecida. De fato, existem relatos na literatura da atividade anti-inflamatória do (-)- - bisabolol e dos extratos da camomila (CAVALIERI et al., 2004; DARRA et al., 2008; GANZERA; SCHNEIDER; STUPPNER, 2006). No entanto, para a comprovação dessa hipótese são necessários testes adicionais. Além disso, o resultado significativo obtido com a dose de 50 mg/kg na primeira fase do teste indica que é pouco provável estar havendo apenas um efeito do tipo anti-inflamatório.
Há relatos na literatura que anestésicos locais, como a lidocaína, são capazes de provocar redução significativa tanto no número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (KARTTUNEN et al., 1988), como na resposta nociceptiva induzida nas duas fases do teste da formalina (ABBADIE et al., 1997; BITTENCOURT; TAKAHASHI, 1997). O mecanismo envolvido na supressão da geração e transmissão do estímulo nociceptivo nesses casos é o bloqueio dos canais para Na+ dependentes de voltagem expressos nas fibras dos neurônios aferentes nociceptivos (ABBADIE et al., 1997; CUMMINS; SHEETS; WAXMAN, 2007; HILLE, 2001). Com essas informações, foi considerada a possibilidade
do (-)- -bisabolol estar suprimindo a resposta nociceptiva induzida nos testes do ácido acético e da formalina por meio de um mecanismo semelhante ao da lidocaína. Para testar essa hipótese foram realizados testes ex vivo com o intuito de observar o efeito do (-)- - bisabolol sobre a excitabilidade das fibras nervosas do nervo isquiático isolado de camundongos.
Foi utilizada a técnica de single sucrose-gap modificada, adaptada para obtenção de registros do PAC a partir do nervo isquiático de camundongos. Como não foi encontrado na literatura, até o presente, relatos do desenvolvimento dessa técnica aplicada ao estudo com nervo isquiático de camundongos, o primeiro passo foi verificar se o modelo era válido. Para isso, foi verificada a viabilidade das fibras do nervo isquiático, analisando o tempo máximo em que os parâmetros do PAC permaneciam invariáveis. Foram realizados também, testes com bloqueadores padrões dos canais para Na+ e dos canais para K+ dependentes de voltagem, como a lidocaína e a 4-AP, respectivamente (HILLE, 2001).
Durante um período máximo de 70 minutos após o registro dos controles, os parâmetros do PAC analisados permaneceram inalterados quando o nervo isquiático era incubado apenas com a solução fisiológica ou solução fisiológica mais Tween 80 (0,1%) (Figuras 14 e 15). Assim, a viabilidade do nervo isquiático foi limitada em um tempo máximo de 70 minutos para incubação com as substâncias-teste e posterior lavagem.
No período de incubação com a lidocaína, a amplitude (VPAC) do potencial de ação
composto foi reduzida e, após 30 minutos de lavagem, revertida completamente (Figuras 16 e 17). Esse efeito já era esperado porque a lidocaína é um bloqueador reversível não-seletivo de canais para Na+ dependentes de voltagem (HILLE, 2001; TOKUNO et al., 2004). Assim, o bloqueio das correntes de Na+ inibe a despolarização e, consequentemente, o disparo de potenciais de ação nas fibras do nervo isquiático estudado (HILLE, 2001). A diminuição na quantidade de fibras responsivas é observada na redução da amplitude do PAC (GONÇALVES et al., 2008; POOLER; VALENZENO, 1983; TOKUNO et al., 2004). Ao contrario da lidocaína, a 4-AP não reduziu significativamente a amplitude do potencial de ação composto (Figuras 20 e 21). A 4-AP é um bloqueador de canais para K+ os quais não estão envolvidos na fase de despolarização do potencial de ação (HILLE, 2001). Portanto, quanto à amplitude do PAC, os resultados não foram diferentes nos testes realizados com a 4- AP em comparação com os testes onde foi utilizada apenas a solução fisiológica no compartimento-teste da câmara de registros eletrofisiológicos.
Os resultados esperados com os bloqueadores padrão também foram confirmados na análise do parâmetro velocidade de despolarização (VDPAC). A partir dos resultados obtidos,
observou-se que a lidocaína (1 mM) reduziu a velocidade de despolarização (Figura 18), enquanto que a 4-AP (1 mM) não produziu nenhuma alteração significativa sobre este parâmetro (Figura 22). Estes resultados indicam que o bloqueio dos canais para Na+
dependentes de voltagem contribui para a redução da velocidade de despolarização. De fato, a lidocaína promove o aumento do tempo em que os canais para Na+ dependentes de voltagem permanecem inativados, o que resulta no aumento do tempo para atingir o pico do PAC (TPPAC) (CATTERALL, 2000; GUVEN et al., 2006; HILLE, 2001). Além disso, a
velocidade de despolarização é calculada como a amplitude (VPAC) em função do tempo para
atingir o pico do PAC (TPPAC), de forma que a diminuição da amplitude é o outro fator que
contribui para a redução da velocidade de despolarização (GONÇALVES, 2008).
A abertura dos canais para K+ dependentes de voltagem, dentre os quais os retificadores retardados, é descrita como sendo um dos eventos importantes na fase de repolarização do PAC (GUVEN et al., 2006). Com a finalidade de analisar uma possível interação entre o as substâncias testadas e os canais para K+ dependentes de voltagem (Kv),
utilizou-se como parâmetro a constante de tempo de repolarização do PAC que possibilita medir alterações causadas durante a fase de repolarização (DE SOUSA et al., 2006). Neste caso, espera-se que compostos que possuam atividade bloqueadora dos canais tipo Kv
aumentem o tempo para a repolarização do PAC, o que pode ser visualizado no registro, como uma redução na inclinação da curva desta fase (Figura 20) (CRUZ et al., 2000; DE SOUSA et al., 2006).
Nos testes de validação, realizados com os bloqueadores padrão dos canais para Na+ e K+, verificou-se que apenas a 4-AP aumentou significativamente a constante de tempo de repolarização ( ) do PAC. Esse resultado foi útil na validação da técnica para as análises de uma possível interação das drogas estudadas sobre os canais para K+ dependentes de
voltagem. Sendo a 4-AP um bloqueador seletivo dos canais para K+ retificadores retardados (HILLE, 2001; MCBRIDE et al., 2006), inibindo as correntes de K+ importantes para o rápido restabelecimento do potencial de membrana de repouso durante a fase de repolarização, espera-se alteração da repolarização do PAC (DE SOUSA et al., 2006; GUVEN et al., 2006). Assim, foi verificado aumento na constante de tempo de repolarização durante o período de incubação com a 4-AP, bem como, a reversão desse efeito após 30 minutos de lavagem (Figura 23).
Os resultados obtidos para a validação da técnica de single sucrose-gap adaptada para nervo isquiático de camundongos foram satisfatórios nos estudos com os bloqueadores padrões, tornando válidas as análises dos parâmetros do PAC para testes posteriores com
compostos ainda não estudados à luz desta técnica. Além disso, quando o nervo isquiático era submetido a uma frequencia de estimulação em torno de 100 Hz foi verificada, como esperado, a ocorrência de efeito uso-dependente nos testes com a lidocaína, diferente do que foi observado quando o nervo era incubado com a 4-AP ou com solução fisiológica (dados não mostrados). Assim, foi dado o prosseguimento nas investigações sobre a possibilidade do (-)- -bisabolol estar produzindo seus efeitos antinociceptivos também por meio do bloqueio da condução nervosa em nível periférico.
No presente estudo, foi demonstrado que o (-)- -bisabolol possui atividade sobre a excitabilidade neuronal em camundongos, evidenciada pela redução da excitabilidade do nervo isquiático isolado desses animais (Figura 24). O composto estudado reduziu a amplitude do PAC, característica relacionada aos compostos bloqueadores de canais para Na+ dependentes de voltagem, como a lidocaína (HILLE, 2001; TOKUNO et al., 2004). No entanto, ao contrário do ocorrido com a lidocaína, a redução na amplitude do PAC causada pelo (-)- -bisabolol não foi revertida após a lavagem. Esse resultado pode estar relacionado à irreversibilidade de ação do (-)- -bisabolol. Além disso, na concentração de 10 mM continuou havendo redução da amplitude do PAC logo após o início da lavagem (Figura 25). É interessante notar que as fibras nervosas situadas em uma região mais interna do nervo isquiático não estão em contato direto com a solução de banho extracelular (KRIZ et al., 2000). Dessa forma, devido à lipossolubilidade do (-)- -bisabolol, esse composto pode continuar se difundindo nas membranas lipídicas das fibras nervosas mesmo após a lavagem. Assim, as fibras situadas em uma região mais interna do nervo podem estar sendo alvo da ação farmacológica do (-)- -bisabolol em um período de tempo posterior à lavagem.
A curva concentração-resposta foi determinada, sendo constatada a dependência de concentração do efeito do (-)- -bisabolol sobre a amplitude do PAC aos 30 minutos de incubação, com o valor da IC50 estimado em 8,9 mM de concentração (Figura 26). Assim,
esse sesquiterpeno se apresentou mais potente em comparação com a (-)-carvona (IC50 = 10,6
mM), um monoterpeno que já foi relatado estar associado à diminuição da resposta nociceptiva induzida no testes do ácido acético e da formalina (GONÇALVES, 2008).
O outro parâmetro relacionado com a fase de despolarização, a velocidade de despolarização, também foi reduzido significativamente durante o período de incubação com o (-)- -bisabolol, de forma semelhante aos testes com a lidocaína. Após a lavagem não houve reversão desse efeito, no entanto, de forma diferente do observado na amplitude do PAC, não houve redução quando eram comparados os resultados com os valores obtidos aos 30 minutos de incubação (Figura 27D). Essa observação pode indicar uma possível ligação
irreversível ou de alta afinidade com os canais para Na+ dependentes de voltagem. Como já foi discutido, esse parâmetro está relacionado com as fibras que continuam responsivas no nervo isquiático (CATTERALL, 2000; GONÇALVES, 2008; HILLE, 2001; KRIZ et al., 2000). A redução na velocidade de despolarização, portanto, corrobora a idéia de que o (-)- - bisabolol pode estar reduzindo a excitabilidade do nervo isquiático por meio do bloqueio dos canais para Na+ dependentes de voltagem.
A constante de tempo de repolarização ( ) não sofreu alteração durante a incubação com o (-)- -bisabolol (Figura 28). Comparando os efeitos produzidos pela lidocaína, 4-AP e pelo (-)- -bisabolol sobre a fase de repolarização observa-se que apenas a 4-AP foi capaz de alterar a constante de tempo de repolarização. Esse resultado sugere que o (-)- -bisabolol não interage com os canais para K+ dependentes de voltagem nas concentrações estudadas.
Em estudo anterior foi demonstrado que a atividade antinociceptiva de compostos terpênicos pode estar associada à redução da excitabilidade neuronal no sistema nervoso periférico. Gonçalves et al., (2008), relacionou o efeito antinociceptivo da (-)-carvona observado nos testes da formalina e do ácido acético, com a redução da excitabilidade neuronal em nervo isolado de ratos. Portanto, existe a possibilidade de haver uma relação semelhante entre a diminuição da resposta nociceptiva e a redução da excitabilidade neuronal causada pelo (-)- -bisabolol nos camundongos. Além disso, o presente estudo associa os resultados obtidos nos testes comportamentais com testes eletrofisiológicos realizados em um único modelo animal. É sabido que mesmo espécies próximas evolutivamente, como o rato (Rattus norvegicus) e o camundongo (Mus musculus), podem responder de forma distinta aos efeitos de uma determinada substância (BEAUDRY et al., 2009). Assim, os resultados obtidos reforçam a relação entre o efeito antinociceptivo observado nos modelos comportamentais e a redução da excitabilidade neuronal do nervo isquiático.
Os resultados obtidos nesse estudo apresentaram um efeito promissor do (-)- - bisabolol como composto antinociceptivo, visto que foi eficaz em dois testes comportamentais para avaliação da resposta nociceptiva. Com o resultado obtido na segunda fase do teste da formalina em uma dose menor, é provável que esse efeito possa estar relacionado com a supressão da síntese, liberação e/ou da ação de mediadores inflamatórios. Além disso, foi demonstrado que pode haver uma relação com a redução da excitabilidade neuronal no sistema nervoso periférico. No entanto, pela análise dos resultados obtidos, não pôde ser completamente descartada a possibilidade de envolvimento de mecanismos centrais de analgesia. Para isso, serão necessários estudos adicionais na tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na resposta antinociceptiva promovida pelo (-)- -bisabolol.
6 CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, conclui-se que:
• O (-)- -bisabolol apresentou atividade depressora do sistema nervoso central, demonstrando ser interessante como substância antinociceptiva;