As 256 plantas F2 foram genotipadas utilizando-se 139 marcadores moleculares
microssatélites, selecionados após a realização de testes de amplificação e polimorfismo para 859 pares de “primers” disponíveis. As sequências de nucleotídeos para a síntese dos “primers” estão disponíveis no banco de dados construído para a cultura do milho, denominado “Maize Genetics and Genomic Database” (http://www.maizegdb.org).
2.2.4 Mapa genético
Os 139 marcadores microssatélites empregados na elaboração do mapa genético apresentaram segregação 1:2:1, referente à população F2, segundo o teste da distorção mendeliana,
que corresponde ao teste de qui-quadrado para os desvios da segregação. O teste foi efetuado empregando-se o nível conjunto de significância α = 5% de probabilidade, a partir do qual foi obtido o nível de significância utilizado no teste da segregação de cada marcador, pelo critério de Bonferroni (PROVINCE, 2001).
O mapa genético foi elaborado utilizando-se o programa Mapmaker versão 3.0b (LANDER et al., 1987; LINCOLN; DALY; LANDER, 1992), partindo-se do mapa construído previamente por Mangolin (2004) utilizando 75 marcadores microssatélites. A esse mapa foram incorporados 64 marcadores selecionados para este trabalho, totalizando os 139. Os grupos de ligação foram estabelecidos utilizando-se o comando “group”, considerando-se “LOD score” igual
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a 3 e distância máxima entre dois locos igual a 50 cM, que é equivalente à freqüência máxima de recombinação de 0,38 conforme a função de mapeamento de Kosambi (1944), empregada na conversão da freqüência de recombinação em distância genética. Os 139 marcadores microssatélites distribuíram-se em 13 grupos de ligação, ocorrendo ainda 3 marcadores não ligados a nenhum grupo, sendo realizada em seguida a reorganização unindo-se os grupos e marcadores localizados em um mesmo cromossomo, formando-se os 10 grupos de ligação correspondentes aos 10 cromossomos do milho. A união dos grupos de ligação e marcadores não ligados foi realizada de acordo com as posições dos marcadores microssatélites nos “bins” cromossômicos, definidas no “Maize Genetics and Genomic Database”, sendo um “bin” correspondente a um intervalo de aproximadamente 20 cM entre dois marcadores (GARDNER et al., 1993). Em cada grupo de ligação, os marcadores foram ordenados utilizando-se os comandos “compare” e “try”. Com o comando “compare”, realizou-se a ordenação de um conjunto de, no máximo, 10 marcadores do grupo de ligação em questão. Para os grupos de ligação possuindo mais de 10 marcadores, as posições dos demais foram estabelecidas utilizando-se o comando “try”. A ordem final dos marcadores em cada grupo de ligação foi conferida utilizando-se o comando “ripple”. O mapa foi finalizado definindo-se o conjunto de marcadores, já ordenados, correspondente a cada cromossomo, utilizando-se os comandos “make chromosome”, “attach”, “framework” e “draw chromosome”.
2.2.5 Delineamento
O delineamento experimental empregado foi o de blocos incompletos em látices simples 16x16. Cada parcela foi constituída por uma linha de 4m, com 0,80m entre linhas e 0,20m entre plantas. Na semeadura foram distribuídas 50 sementes por parcela, sendo realizado desbaste após aproximadamente 30 dias, utilizado-se estande de 20 plantas por parcela, o que corresponde a 62.500 plantas ha-1.
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2.2.6 Ambientes
Os experimentos foram conduzidos em 9 ambientes, em que cada ambiente foi correspondente à combinação local x ano. Os ambientes utilizados foram Estação Experimental Fazenda Areão (E. E. Areão) e Estação Experimental Fazenda Caterpillar (E. E. Caterpillar) nos anos agrícolas 2001/2002, 2002/2003 e 2003/2004, Estação Experimental Departamento de Genética da ESALQ/USP (E. E. Depto. Genética) nos anos agrícolas 2002/2003 e 2003/2004 e Estação Experimental Fazenda Anhembi (E. E. Anhembi) no ano agrícola 2003/2004. O preparo do solo, semeadura e tratos culturais seguiram as recomendações técnicas correspondentes a cada ambiente. Nas Estações Experimentais Departamento de Genética e Fazenda Anhembi os experimentos foram irrigados quando necessário.
2.2.7 Caracteres
Os caracteres avaliados neste trabalho foram:
i) Estande (Std): corresponde ao número de plantas parcela-1;
ii) Prolificidade (Prol): número de espigas planta-1 obtido para cada parcela dividindo-se o
número de espigas pelo estande da parcela. A contagem das espigas foi efetuada considerando- se aquelas maiores e mais bem formadas ou sem falhas. As espigas menores e/ou apresentando falhas foram reunidas em grupos de duas, três ou mais espigas, e os grupos foram contabilizados como equivalentes a uma espiga bem formada;
iii) Produção de grãos (PG): peso de grãos da parcela, em kg parcela-1;
iv) Teor de umidade dos grãos (Umi): teor de umidade, em %, obtido de uma amostra de grãos de
cada parcela, utilizando-se determinador eletrônico Dickey-John;
v) Peso de 500 grãos (P500): peso, em g, de 500 grãos contados após a debulha das espigas em
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vi) Comprimento de espiga (CE): comprimento médio da espiga, em cm;
vii) Diâmetro de espiga (DE): diâmetro médio da espiga, em cm;
viii) Diâmetro de sabugo (DS): diâmetro médio de sabugo, em cm;
ix) Profundidade de grãos (Prof): correspondeu à diferença (DE −DS)/2, em cm, para cada
parcela;
x) Número de fileiras (NFil): número médio de fileiras de grãos nas espigas;
xi) Número de grãos por fileira (NGFil): número médio de grãos por fileira nas espigas.
Para as análises estatísticas, o caráter PG foi corrigido para a umidade padrão de 15% e convertido para g planta-1 dividindo-se o valor correspondente em g parcela-1 pelo estande médio do experimento. Para as análises dos caracteres PG e Prol foram avaliadas todas as plantas da parcela, enquanto os caracteres CE, DE, DS, Prof, NFil e NGFil foram obtidos de uma amostra de cinco espigas de cada parcela, sendo a média aritmética da amostra utilizada nas análises. As amostras foram retiradas dentre as cinco espigas mais bem formadas de cada parcela, de forma a facilitar a visualização e as avaliações do número de fileiras e de grãos por fileira.
Os caracteres PG e Prol foram avaliados em todos os 9 ambientes considerados. As avaliações dos demais caracteres foram realizadas em 7 ambientes, uma vez que não foram tomados os dados nas Estações Experimentais Fazenda Areão e Fazenda Caterpillar no ano agrícola 2001/2002.
2.2.8 Análises de variâncias
Foram realizadas, para cada caráter, as análises de variâncias por ambiente e também a análise conjunta (Tabela 1), utilizando-se o programa SAS versão 8.2, módulo “proc glm”. O modelo estatístico utilizado na análise conjunta (eq. 5), cujos efeitos, à exceção da média, foram considerados aleatórios, foi o seguinte (COCHRAN; COX, 1966):
47 ijkl il l jl k l j i ijkl p r b a pa e y =µ+ + () + ( ) + +( ) + (5) em que ijkl
y é o valor observado da progênie i na repetição j, no bloco k, no ambiente l,
µ é a média geral do experimento,
i
p é o efeito da progênie i (i =1, 2,..., 256),
( )
j l
r é o efeito da repetição j (j =1, 2) dentro do ambiente l,
( )
k jl
b é o efeito do bloco k (k =1, 2,...,16) dentro da repetição j, dentro do no ambiente l,
l
a é o efeito do ambiente l (l =1, 2,..., 9),
il pa)
( é o efeito da interação progênies x ambientes,
ijkl
e é o erro associado à observação yijkl.