Segundo Reynolds e Meikle (1997) e Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) a destruição tecidual característica da periodontite, outrora considerada efeito direto das bactérias e seus produtos é hoje considerada efeito principalmente dos produtos do hospedeiro, liberados no local devido à invasão de produtos bacterianos. Os produtos liberados pelas bactérias são capazes de estimular respostas inflamatórias e imunológicas altamente ricas em mediadores como prostaglandinas, IL-1, TNF e outros que por sua vez estão ligados à ativação das formas latentes em formas ativas de MMPs.
Segundo Kinane e Lindhe (1999) as proteases, tanto as produzidas pelos microorganismos quanto as do próprio hospedeiro, têm importância fundamental para o processo destrutivo.
De Souza e Line (2002) afirmam que os altos níveis de MMPs nos tecidos periodontais são os responsáveis pelo desequilíbrio entre produção e degradação de colágeno causando destruição periodontal.
Fibroblastos, queratinócitos, macrófagos e células endoteliais respondem de maneira parecida, produzindo e liberando MMPs mediante estímulos de mediadores catabólicos como IL-1, TNF-α, TGF-α, EGF, bFGF e PDGF e
inflamatórios como a PGE2 (BIRKEDAL-HANSEN 1993; Van DYKE; LESTER;
SHAPIRA, 1993; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nishikawa et al. (2002) estudaram o efeito da TNFα e da PGE2 na produção
de MMPs por fibrobastos do ligamento periodontal mantidos em cultura. As culturas foram tratadas com TNFα e PGE2 e tiveram posteriormente o RNAm
extraído e examinado pelas técnicas do RT-PCR, zimografia e Western blot. Foi detectada produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-13 de forma dose-dependente da adição de TNFα e aumento da produção das 3 MMPs com o passar do tempo.
Alvares et al. (1995) estudaram a produção de MMP-1 e TIMP-1 por fibroblastos do ligamento periodontal mediante estímulos de IL-1β, PDGF e TGF- β. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e tratadas com as citocinas e fatores de crescimento citados e então o RNAm produzido na cultura foi extraído e estudado pela técnica RT-PCR para detecção de RNAm para MMP-1 e TIMP-1. A IL-1β causou grande aumento na produção de RNAm para MMP-1, um aumento menos expressivo foi detectado com o PDGF enquanto que o TGF-β, ao contrário, provocou inibição. Não houve nenhum efeito significativo em relação à TIMP-1.
Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) afirmaram que fragmentos de gengiva inflamada apresentam mais colagenase que fragmentos de gengiva sadia, colagenases detectadas no fluido do sulco gengival estão em quantidade maior em gengivas com doença periodontal, inclusive sendo correlacionados com
severidade aumentada da doença. As MMPs mais comumente detectadas são a colagenase-2 ou MMP-8, acompanhada da MMP-9.
De acordo com Genco (1992) a degradação do tecido mole na doença periodontal ocorre devido à ação de enzimas bacterianas e enzimas do hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases da matriz (MMPs). Haake et
al. (2004) afirmam que as MMPs são consideradas as proteinases primárias
envolvidas na degradação dos tecidos periodontais.
Smith et al. (2004) estudaram a expressão da MMP-9 no epitélio gengival de indivíduos com doença periodontal para determinar a participação desta na degradação da membrana basal e inferir sua participação na migração do epitélio juncional para apical na formação da bolsa periodontal. Uma análise zimográfica em biópsias gengivais demonstrou que tanto o epitélio quanto o tecido conjuntivo de amostras de periodontite expressaram capacidade colagenolítica correspondente à expressão de MMP-2 e MMP-9. Altos níveis de pró-MMP-9 foram encontrados no epitélio da bolsa quando comparados ao epitélio sulcular normal. A mesma diferença não pôde ser detectada para a pró-MMP-2. A MMP-9 mostrou-se distribuída por todas as camadas epiteliais tanto do epitélio juncional quanto do epitélio da bolsa e fraca expressão e distribuição no tecido conjuntivo gengival. Forte marcação para MMP-9 foi detectada em leucócitos polimorfonucleares. Os ceratinócitos do epitélio gengival foram identificados como fonte importante de MMP-9 no epitélio gengival inflamado.
Segundo Birkedal-Hansen (1993) a presença das MMPs é muito importante para o início da reabsorção óssea uma vez que os osteoblastos são capazes de produzir MMPs quando estimulados por fatores estimuladores de reabsorção iniciando o processo reabsortivo, já que o osteoclasto não produz estas enzimas sendo responsável apenas pela dissolução da matriz mineral, o que corrobora o fato da reabsorção óssea periodontal ser tão sensível à presença de estimuladores da produção de MMPs como a IL-1 e o TNF- .
Conforme Grenier e Mayrand (2001) na inflamação periodontal causada por periodontopatógenos, as MMPs são produzidas de maneira descontrolada e ocorre um desequilíbrio entre a atividade de MMPs e de TIMPs resultando em degradação tecidual.
Segundo Genco (1992) está claro que as bactérias do biofilme são capazes de ativar diretamente MMPs ou inibir a ação dos TIMPs, bem como indiretamente através da estimulação de células do hospedeiro a produzirem citocinas que por sua vez induzem outras células como fibroblastos e ceratinócitos a produzirem colagenases.
Enzimas bacterianas, como a protease semelhante à quimiotripsina produzida pela bactéria Treponema denticola, e outras substâncias liberadas pelas bactérias Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Fusobacterium nucleatum são capazes de ativar as MMPs assim como as células
do próprio hospedeiro estimuladas por citocinas (BIRKEDAL-HANSEN, 1993; HAAKE et al., 2004a; HAAKE et al., 2004b; GENCO, 1992; MALDONADO et al., 2004; WAHL; CORCORAN, 1993).
Nakaya et al. (1997) estudaram em culturas de células de ligamento periodontal a indução de MMP-3, ou estromelisina-1, pela IL-1β. Foi encontrado que as células cultivadas apresentaram aumento da produção de MMP-3 na presença de IL-1β de forma dependente da concentração desta última.
Grenier e Mayrand (2001) realizaram um estudo com o objetivo de determinar se o Porphyromonas gingivalis possui a capacidade de degradar e/ou inativar a TIMP-1. A análise em eletroforese mostrou que a Porphyromonas
gingivalis foi capaz de degradar a TIMP-1 em vários fragmentos. Foi demonstrada
inibição de MMP-9 quando adicionada no ensaio TIMP-1 tratada com bactérias previamente aquecidas para inativação das proteases. A mesma inibição da MMP- 9 não foi observada quando a TIMP-1 adicionada havia sido tratada com bactérias proteoliticamente ativas, significando que inibição da TIMP-1 pelo P. gingivalis tem efeito claro sobre a MMP-9 e, portanto, também sobre a degradação da matriz
extracelular. Os autores concluem que a degradação periodontal pode ser favorecida pelo aumento significante de MMPs ativas, causada pela redução dos seus inibidores (TIMPs), nos sítios onde existe a presença de P. gingivalis.
O Porphyromonas gingivalis, também foi investigado por Pattamapun et al. (2002) com relação à sua capacidade de induzir ativação de MMP-2 em células do ligamento periodontal. Culturas de fibroblastos do ligamento periodontal foram obtidas e então sofreram a adição de sobrenadantes de culturas de P. gingivalis. Foi demonstrado que o P. gingivalis possui a capacidade de induzir ativação de MMP-2 em células do ligamento periodontal além de aumentar a expressão de MT1-MMP detectados pelas técnicas de RT-PCR e Western.
Wahl e Corcoran (1993) demonstraram que, devido à capacidade do interferon γ (IFNγ) e da interleucina-4 (IL-4) de suprimirem a produção de PGE2
que é um mediador inflamatório envolvido na estimulação de produção de MMPs,
estas citocinas apresentaram-se capazes de reduzir a produção de PGE2 no meio
de cultura, levando à redução da produção de colagenase intersticial e colagenase/gelatinase 92kDa.
De acordo com Kubota, T. et al. (1996), as principais colagenases presentes no tecido gengival podem ser a MMP-1 e a MMP-8, tendo a primeira sido mais relacionada à Periodontite Juvenil e a segunda à Periodontite do Adulto. Estes autores detectaram níveis de RNAm para MMP-1, MMP-3, MMP-8 e TIMP-1 maiores em gengivas afetadas pela periodontite que em indivíduos saudáveis mas não os de RNAm para TIMP-2. Fatores como o TGF- e o FGF básico mostraram- se capazes de aumentar a produção de TIMP-1. Concluíram que o aumento sinérgico da produção de MMP-1, MMP-3 e MMP-8 é importante para a destruição tecidual encontrada na doença periodontal e que o aumento da TIMP-1 pode ser uma tentativa do organismo de compensar o aumento das metaloproteinases.
Chang et al. (2002) estudaram a influência de IL-1α, TGF-β, e produtos das bactérias P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans na expressão das MMPs em culturas de fibroblastos do ligamento periodontal. A análise zimográfica mostrou a
presença de MMP-2 e MMP-9 nos meios de cultura adicionados com extratos de
P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. A IL-1α elevou a produção de MMP-2
ao longo do tempo enquanto a TGF-β causou redução.
A MMP-8 foi demonstrada ser produzida por neutrófilos e por fibroblastos periodontais em pacientes com síndrome de Down com diagnóstico de gengivite e periodontite em quantidades maiores que em pacientes com a mesma síndrome sem doença periodontal (HALINEN et al., 1996).
A MMP-8, foi estudada por Figueredo et al. (2004) em relação à sua atividade detectada no fluido gengival após tratamento periodontal não cirúrgico. Em pacientes com periodontite que receberam tratamento periodontal composto de procedimentos básicos, foi coletado fluido gengival antes do início do tratamento e no trigésimo dia após o término. Além de melhorias significativas nos parâmetros clínicos observados, foi observada redução significativa nos níveis de MMP-8 nos sítios com gengivite e com periodontite de pacientes com diagnóstico de periodontite.
Meyer et al. (1997) realizaram um estudo que teve como objetivo comparar os níveis de elastase ativa (AE), um componente dos grânulos primários dos neutrófilos que causam destruição tecidual (KINANE; LINDHE, 1999), e do complexo elastase-inibidor de proteinase α-1 (E-α-1 PI) no fluido gengival entre pacientes com periodontite de progressão rápida e periodontite do adulto. Os resultados de coleta de fluido gengival demonstraram que os níveis de AE e E-α-1 PI foram considerados insignificantes nos pacientes controle (sulco gengival de pacientes sem periodontite). Nos pacientes com periodontite, níveis significativamente aumentados de AE, mas não do complexo E-α-1 PI, foi encontrado, independentemente do tipo de periodontite, razão pela qual os autores consideraram esta enzima como um marcador de doença.
Garlet et al. (2004) estudaram a expressão de MMPs e TIMPs, do fator osteoclastogênico RANKL e da ospeoprotegerina em periodontite agressiva e periodontite crônica. O RNAm foi extraído de biópsias gengivais e analisado pela
técnica RT-PCR em relação à expressão para MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, RANKL, OPG, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10. Foi constatado que a expressão para as MMPs e as TIMPs analisadas no estudo foi significativamente maior nos casos de periodontite, tanto crônica quanto agressiva, que nos pacientes controle, sem periodontite, sem diferença significante entre o tipo de periodontite exceto para a TIMP-1 e TIMP-3 que foram mais expressas em periodontite agressiva que em periodontite crônica.
Soell, Elkaim e Tenenbaum (2002) estudaram em biópsias gengivais e fluido do sulco gengival de 11 pacientes com periodontite e 5 pacientes saudáveis os níveis de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2, além da enzima Catepsina C. As enzimas e os inibidores em questão foram quantificados e tiveram suas atividades mensuradas através das técnicas ELISA, Western blot e análise zimográfica. Todas as MMPs estudadas mostraram níveis maiores em pacientes com periodontite que nos pacientes controle tanto nas biópsias quanto no fluido do sulco gengival. As TIMP-1 e TIMP-2 mostraram-se reduzidas nos pacientes com periodontite. As atividades das MMPs também estavam aumetadas nos casos de periodontite.
Maldonado et al. (2004) considerando a já conhecida maior prevalência de periodontite em diabéticos, realizaram um trabalho com o objetivo de estudar a produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, em histiócitos previamente expostos a altas concentrações de glicose. Histiócitos e fibroblastos gengivais foram cultivados e expostos a concentrações de 5 e 25 mM de glicose, tidas como normal e excessiva respectivamente e então tratados com lipopolissacarídeos isolados de Escherichia coli. Os resultados mostraram que a produção de MMP-1 foi estimulada pela adição de LPS tanto na cultura com glicose normal quanto na com glicose aumentada, e esse estímulo ocorreu de uma maneira dependente da concentração. Quando a adição da glicose em alta concentração foi realizada no mesmo momento da adição do LPS, a expressão de MMP-1 foi comparável à da cultura com glicose em concentração normal, diferentemente de quando a adição de altas concentrações de glicose foi realizada
previamente. Isso significa que a pré-exposição prolongada à glicose em altas concentrações é necessária para que a secreção de MMP-1 seja superestimulada pelo LPS. Foi observado então que a glicose em excesso aumenta a produção de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos mais que a expressão de TIMP-1 nos histiócitos. A expressão de RNAm para MMP-1, MMP-7, MMP-8 e MMP-9 foi considerada maior nas células expostas a glicose em altas concentrações que em células com glicose normal, fato encontrado também nas células expostas a lipopolissacarídeos. O aumento na produção de MMPs nesses casos é devido ao aumento da expressão do RNAm.
O estudo acima citado conclui então que a pré-exposição de fagócitos mononucleares a altos níveis de glicose aumentam a expressão de MMP-1 estimulada por lipopolissacarídeos, levando a crer que pacientes diabéticos com hiperglicemia têm maior susceptibilidade dos seus fagócitos à liberação de substancias responsáveis pela degradação de tecido periodontal frente à presença dos principais patógenos periodontais.
Existe um grande potencial clínico nos campos do diagnóstico e tratamento da doença periodontal com a evolução do entendimento do papel das MMPs nesse processo (GENCO, 1992; Van DYKE; LESTER; SHAPIRA, 1993).
No diagnóstico, representa a busca por testes que detectem os fatores que resultarão na perda óssea antes que ela venha a ocorrer ou que forneçam meios de se acompanhar a atividade de doença ao longo da etapa de controle e manutenção do tratamento periodontal. Neste sentido, testes que, no futuro, poderão ser feitos em consultórios ou até em casa, capazes de detectar MMP-8 no fluido do sulco gengival, vem sendo testados com resultados mostrando diferenças nos seus níveis entre pacientes com ou sem doença periodontal. No campo do tratamento, inibidores de MMPs com as tetraciclinas e seus derivados têm sido testados e tem mostrado capacidade de inibir MMP-8, -9 e -14 (SORSA; TJÄDERHANE; SALO, 2004).
De Souza et al. (2005) realizaram um estudo com o objetivo de correlacionar o polimorfismo na região promotora dos genes MMP-9 e TIMP-2 com a doença periodontal, o que representaria um importante achado na busca pelo diagnóstico precoce de indivíduos de risco. Os resultados demonstraram que pacientes diagnosticados com periodontite crônica não apresentaram associação com o polimorfismo no gene MMP-9. O genótipo T/T, considerado o de maior transcrição de MMP-9, não foi encontrado em nenhum paciente com periodontite. A análise de polimorfismo para o gene TIMP-2 mostrou que 99% dos indivíduos tinham o mesmo genótipo, não sendo possível fazer qualquer tipo de inferência.
Para Björnsson et al. (2004) uma vez que a associação entre MMPs e progressão da doença periodontal está estabelecida, esforços devem ser feitos para inibir estas enzimas. Neste trabalho, os autores fazem uso de um inibidor sintético das MMPs, o Batimastat (BB-94), que age de forma competitiva, inibindo reversivelmente a ação da MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 e MMP-14 em ratos com periodontite induzida por ligaduras. Ratos que receberam o Batimastat, com ou sem ligaduras, apresentaram perdas ósseas significativamente maiores que os grupos placebo e controle. Os autores concluíram que o Batimastat não foi capaz de reduzir a progressão da perda óssea periodontal, e sim aumentá-la significantemente. Isto pode se dever ao fato do Batimastat ser um inibidor de MMPs de amplo espectro, portanto inibindo ações essenciais comandadas por MMPs no reparo de feridas. Outro fato importante é o de que ratos mutantes deficientes em MMP-14 apresentam doenças degenerativas e inflamatórias do metabolismo ósseo como osteopenia e artrite generalizada. Sendo então a MMP-14 essencial para o metabolismo ósseo, e estando os ratos desta pesquisa em fase de crescimento, a deficiência de MMP-14 devido à inibição causada pelo Batimastat teria feito destes ratos semelhantes àqueles com mutação e, portanto, com deficiência no metabolismo ósseo. Portanto, esta pesquisa demonstra que embora as MMPs participem de forma importante na perda de inserção periodontal, alguns membros dessa família possuem algum efeito protetor ainda não identificado.
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo tem como objetivo estudar através de análise imuno- histoquímica a expressão das enzimas MMP-1, MMP-2 e MMP-9 no tecido gengival acometido por Gengivite Induzida por Placa e por Periodontite Crônica bem como identificar os locais de expressão destas metaloproteinases nos tecidos epitelial e conjuntivo, visando a obtenção de dados que sugiram se a presença e/ou o grau de expressão destas enzimas estão relacionados com os vários processos inerentes ao hospedeiro responsáveis pela diversidade na apresentação da doença periodontal entre os indivíduos.