Lakkaz Medyatör Sistemleri

Bazen substratlar enzimin aktif merkezine giremeyecek kadar büyük oldukları için ya da yüksek redoks potansiyellerine sahip oldukları için lakkazlar tarafından yükseltgenemezler. Bu sınırlamayı ortadan kaldırmak çoğu kez ortama bir kimyasal

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Şekil 2.16. Lakkaz moderatör (medyatör) oksidasyon sisteminin katalitik reaksyion şeması (D’acunzo ve ark. 2002).

Gülşen KAYA Bir kaç istisna hariç fungal lakkazların redoks potansiyelleri 0.4 - 0.8 V arasında değişir (Kertsen ve ark. 1990, Kumar ve ark. 2003). Bu değer Cu2+

/Cu+ iyonlarının sudaki redoks potansiyeli (~ 0.15 V) ile kıyaslandığında çok yüksek bir değerdir (Sheldon ve Arends 2004). Lakkazın redoks potansiyelinin yüksek olması, metal iyonu ile protein iskeleti arasındaki koordinasyon, sistemin gergin bir geometriye sahip olmasına yani, yüksek bir redoks potansiyeline sahip olmasına yol açar. Örneğin enzimin aktif merkezindeki T1 bu nedenledir ki ~ 0.6 V’luk redoks potansiyeline sahip TEMPO’nun N-OH grubu yükseltgenerek ilgili okzal amonyum katyonuna transformasyonunu gerçekleştirebilmektedir (Rychnovsky 1999). Lakkazlar iyonlaşma potansiyelleri T1 bakır iyonunun redoks potansiyeline yakın bileşikleri direkt olarak yükseltgeyebilirler (Xu 1997). 1990’da ABTS’nin diamonyum tuzunun lakkaz substrat medyatörü olarak ya da enzimin katalitik etkinliğini artıran bir unsur olarak kullanılabileceği anlaşılınca lakkazlar tarafından yükseltgenebilen bileşiklerin sayısı ciddi bir şekilde artmıştır (Bourbonnais ve Paice 1990).

İdeal bir lakkaz medyatörü, iyi bir lakkaz substratı özelliğine sahip olmalıdır; onun yükseltgenmiş ya da indirgenmiş formları kararlı olmalı ve enzimatik reaksiyonu inhibe etmemelidir ve redoks dönüşümü çevrimsel olmalıdır (Johannes ve Majcherczyk 2000). Medyatör, enzimatik oksidasyonunda, yüksek redoks potansiyeline sahip kararlı ürünler veren, düşük molekül ağırlıklı lakkaz substratı olarak düşünülebilir. (Bourbonnais ve ark. 1998). İdeal bir redoks medyatörünün yan ürün oluşturmadan ve kendisi bozunma- dan çok sayıda katalitik çevrimin gerçekleştirilmesine olanak sağlamalıdır. Bu özellikleri taşıyan sınırlı sayıda bileşik vardır. Bunlardan bazıları; geçiş elementlerinin değişik kompleksleri (potasyum oktasiyanomolibdat ve oktasiyanotungustat) demir- II’nin o-fenantrolin ve 4,4’-dimetilbipiridin ile yaptığı kompleksler ile ABTS ve TEMPO (1,1,6,6-tetrametil-1-piperidiniloksil) gibi. Bu bileşikler yeterli büyüklükte

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Şimdiye dek lakkaz redoks medyatörü olarak bütün beklentileri karşılayan bir bileşik bulunamamıştır. Lakkaz redoks medyatörü olarak tanımlanan bileşikler, enzimatik reaksiyon sırasında düşük kararlılığa sahip ara ürün oluştururlar ve buna bağlı olarak da non-fenolik bileşiklerin katalitik oksidasyonu için az sayıda redoks çevriminin gerçekleştirilmesine olanak sağlarlar. Bu yüzden bu bileşikler için “medyatör” olarak değil lakkazın kinetik etkinliğini “iyileştirici (enhancer)” teriminin kullanılması daha doğru bulunmaktadır. Bu terim gerçek redoks medyatöründen farklı olarak, oksidasyonları daha fazla dönüşüme olanak veren aktif radikal oluşumunu artıran bile- şikleri kapsamaktadır. (Medyatör, enzimatik oksidasyonla yüksek redoks potansiyeline sahip ürün oluştururken kendisi korunabilen bileşikleri kapsar.) Son zamanlarda lakkazın katalitik etkinliğini iyileştiren (lakkaz iyileştirici, Lİ) bileşiklerle ve işlem esnasında yer aldığına inanılan mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik araştırmalar yapılmıştır. Bu bileşiklerin çoğu gerçek redoks medyatörü değildirler. Çünkü bir veya birkaç çevrimden sonra kimyasal transformasyon sonucu elimine olmaktadırlar. Lİ olarak kullanılan bileşikler genel olarak >N-OH veya >N-O yapısal gruplarını içerirler. 1-hidroksibenzotriazol (HBT), TEMPO, N-hidroksiftalimid (HPI), violurik asit (VA) ve N-hidroksiasetanilit (HAA) bu bileşiklerden bazılarıdır (Xu ve ark. 2001). Deneyler, T.

villosa lakkazı ile alkil arenlerin oksidasyonunda >N-OH tipi bu dört iyileştirici (HBT,

HPI, VA ve HAA) arasında en etkililerinin HBT olduğunu göstermiştir (Cantarella 2003). Değişik >N-OH bileşiğinin katalitik oksidasyon yeterliliği lakkazın T1 Cu potansiyeli ile >N-OH bileşiğinin redoks potansiyeli arasındaki farka bağlı olan log(kcat

/ KM) ifadesiyle tanımlanmaktadır.

Aynı fenolik olmayan substrat ve medyatör/iyileştirici varlığında farklı funguslardan elde edilen lakkazların katalitik etkinliklerinin farklı olduğu gösterilmiştir (Li ve ark. 1999). TEMPO’nun ABTS, HBT, VA, HPI ve doğal lakkaz medyatörü 3- hidroksiantranilik asitten medyatör/iyileştirici olarak daha etkili bir bileşik olduğu gösterilmiştir. TEMPO çözeltide kısmen kararlı N-oksil radikali formunda bulunur. Bu da lakkaz ortamda olmadan substratın yükseltgenmek üzere yüksek potansiyele sahip olacak şekilde öncü modifikasyonunu sağlar.

Gülşen KAYA

Şekil 2.18. Lakkaz ve TEMPO’nun varlığında substratın yükseltgenme

mekanizması (Fabbrini ve ark. 2002)

Lakkaz, TEMPO’yu substratla etkileşecek form olan okso-amonyum oluşturacak şekilde yükseltger. Proton ayrılması TEMPO’nun yükseltgenmiş ve indirgenmiş (N-OH) formlarını ürün olarak verir. İndirgenmiş TEMPO lakkaz tarafından yeniden oksa-amonyum verecek şekilde yükseltgenir (Şekil 2.18).

Lakkaz iyileştirici olarak kullanılan diğer organik bileşik sınıflarından nitrozo bileşikleri ile fenotiyoazin türevleri sayılabilir (Şekil 2.19) (Bourbonnais ve ark.1997). Bir fenotiyoazin türevi olan fenotiyoazin-10-propiyonik asit tekstil endüstrisinde indigo deklorizasyonunda lakkaz medyatörü olarak Novazymes firması (Danimarka) tarafından DeniLite® ticari formülasyonunda kullanılmaktadır (Morozova ve ark. 2007). Ancak firmanın Türkiye distribitörlüğü ile yapılan görüşmelerde medyatör olarak Metil- Siringate kullanıldığı ifade edildi.

2. KAYNAK ÖZETLERİ

Şekil 2.19. Lakkaz medyatörü olarak kullanılan bazı bileşikler (Bourbonnais ve ark.1997).

T. versicolor lakkazı için fenoller ve aromatik aminler yüksek potansiyele sahip

iyileştiricilerdendir. Fenol, anilin, p-hidroksibenzoat ve p-hidroksibenzil alkol bu enzim için ABTS ve HBT kadar yeterli medyatorik etkiye sahiptirler. Metiyonin, sistein ve indirgenmiş glutatiyon da T. versicolor lakkazı için etkin iyileştiricilerdendirler (Johannes ve Majcherczyk 2000).

Benzoik ve 3-hidroksiantranilik asitler gibi doğal bileşikler de medyatör olarak etkiyebilirler. Pycnoporus cinnabarinus beyaz çürükçülünün bir metaboliti olan 3- hidroksian tranilik asit, yine bu fungusun lakkazının, fenolik olmayan lignin yapılarını yükseltgemesinde medyatör olarak etki ettiği gösterilmiştir (De Jong ve ark. 1994). Genellikle indikatör olarak bilinen fenol kırmızısı ve onun türevlerinin (diklorofenol red gibi) Polyponus pinsitus lakkazı için medyatör etkisine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu bileşiklerin fenolik olmayan 4-hidroksibenzil alkolün yükseltgenmesinde medyatör olarak etkileri, doğal lakkaz medyatörü 3-hidroksiantranilik asitten on kat daha etkili oldukları gösterilmiştir (D'Acunzo ve Galli 2003).

Gülşen KAYA Katı besiyerinde doğal lignoselülotik substratlar üzerinde salgılanan lakkazlarla birlikte tanımlanmamış medyatör bileşiklerin varlığı fark edilmiştir (Leontievsky 1999). Homojen, yoğunlaştırılmış çözeltilerinin sarı-kahverengimsi renginden dolayı bu lakkazlar “SARI” olarak adlandırılır. Bu lakkazlar ilk olarak Pinus tigrinus’un katı faz (buğday samanı) inkübasyonunda çoklu formda oldukları fark edildi. Aynı fungus sıvı besiyerine inkübe edildiğinde “MAVİ” lakkaz salgıladığı belirtilmektedir. Sarı ve mavi lakkazların aynı molekül ağırlığına, aynı izoelektrik pH değerine, aktif merkezlerinde dört Cu iyonuna ve fenolik substratların oksidasyonunda aynı kinetik değerlere sahip oldukları belirtilmektedir. Aradaki fark sarı lakkazın 600 nm’ de mavi lakkazın sahip olduğu absoprsiyon değerine sahip olmamasıdır. Bu lakkazlar herhangi bir redoks iyileştirircisine ya da medyatöre gereksinim duymadan fenolik olmayan model lignin yapılarını (örneğin veratril alkol veya dimerik bileşikleri) yükseltgeyebilmektedir.

Pleurotus ostreatus’un katı faz inokülasyonuyla medyatör olmaksızın antreseni,

antrakinona yükseltgeyen “SARI LAKKAZ” salgıladığı bilinmektedir (Pozdnyakova 2006). Bu veriler katı faz inkübasyonuyla salgılanan lakkazların doğal medyatörleri enzimatik olarak yükseltgemesi sonucu oluşan radikallerin, proteinin üçüncül yapısında modifikasyona yol açacak şekilde yapılarında bulunan amino asitlerle etkileşmiş olabileceği fikrini doğurmuştur. Ancak bu düşünceyi doğrulayacak deneysel veriler hala elde edilememiştir.

Lakkaz medyatörü seçiminde bir takım kriterlerin göz önüne alınması önerilmektedir ;

1. Bileşik konjüge çift bağlar, hetero siklik atomlar, -OH ve –NH2 grupları gibi

fonksiyonel gruplardan birkaçını ya da tümünü içermelidir.

2. KAYNAK ÖZETLERİ

- ABTS Aracılı Sistem

Organik bileşikler içerisinde redoks medyatörü tanımına en iyi uyan bileşik ABTS’dir. Lakkaz-ABTS medyatör sisteminin yükseltgeme işlemini iki aşamada gerçekleştirdiği gösterilmiştir (Bourbonnais ve ark. 1998, Fabbrini ve ark. 2002).

Şekil 2.20. ABTS’de elektron akışı (Fabbrini ve ark. 2002)

İlk aşamada ABTS+

katyon radikali oluşur. Bunu katyon radikalinin ABTS2+ ye yavaş bir şekilde yükseltgenmesi izler (Şekil 2.20). Ag/AgCl referans elektroda karşı ABTS/ABTS+ çifti için redoks potansiyeli 0.472 V ve ABTS+. /ABTS2+ için 0.885 V olarak ölçülmüştür. Yapılan araştırmalarda ligninin fenol gruplarının lakkaz tarafından yükseltgenmesi ABTS’nin varlığında arttığı gösterilmiştir. Ancak ligninin fenol gruplarının yükseltgenmesi için ABTS+’

ye gereksinim duyulurken ABTS2+ fenolik olmayan grup ların yükseltgenmesinde rol alır. Fakat ABTS+. nin indigo gibi organik boyaların yıkımında medyatör olarak işlev görmesi önerilen mekanizmaya kuşku ile yaklaşılmasına yol açmıştır. Çünkü indigo boya fenolik lignin yapısında değildir ve önerilen mekanizmaya göre ona ABTS2+nin medyatör olarak etkimesi gerekirdi. Kaldı- ki indigo boyanın yıkımında medyatör olarak etkiyen ABTS+ _{işlem sonunda başlangıç} yapısına (ABTS) indirgenir (Solís ve ark. 2005).

Gülşen KAYA

- 1-hidroksibenzotriazol (HBT) Aracılı Sistem

HBT (1-hidroksibenzotriazol Şekil 2.21) N-OH grubu içeren heterosiklik bir bileşiktir ve lakkaz tarafından yükseltgenirken nitroksit katyon radikali oluşturur. Hamur özünün ağartılması üzerine yapılan denemelerde lakkaz/HBT sistemi iyi sonuçlar vermiştir ve odunda hakim fenolik olmayan β -O-4-bağlı alt üniteleri ve ayrıca β -1 bağlı dimerleri yükseltgeyebilme yeteneğine sahiptir.

N

N

N

O

H

Zille ve ark. (2005), Trametes villosa esaslı lakkaz ile HBT medyatörünü kullanarak sübstitüe anilinlerin polimerleşmesini katalizlemeyi başarmışlardır. Bu medyatör geri dönüşümlü olarak kullanılamamaktadır. Lakkaz/HBT sisteminin nasıl çalıştığı tam olarak anlaşılamamakla birlikte ABTS gibi HBT’ nin yapıya girecek kadar küçük olduğu bilinmektedir (Bar 2001).