Kullanılan Çözeltiler ve Besiyerlerinin Hazırlanması

 Hidrofobik jelin dengelenmesi için kullanılan tampon: 1M

(NH4)2SO4 içeren, 0.1 M Na2HPO4 tamponu (pH 8.0); 14.2 g (0.1 mol) Na2HPO4 ve 132.14 g (1 mol) NH4(SO)2 950 mL distile suda çözülerek, 1N HCl ile pH‟sı 8.0‟e getirildi ve son hacim distile su ile 1 L‟ye tamamlandı.

 Hidrofobik jele bağlanmıĢ PON1 enziminin elüsyonu için kullanılan çözelti: 1M NH4(SO)2 içeren, 0.1 M Na2HPO4 tamponu (pH 8.0) ve 0.1 M Na2HPO4 tamponu (pH 8.0) ile gradient mikser kullanılarak tuz gradienti oluşturuldu; 14.2g (0.1 mol) Na2HPO4 ve 132.14 g (1 mol) NH4(SO)2 950 mL distile suda çözülerek, 1N HCl ile pH‟sı 8.0‟e getirildi ve son hacim distile su ile 1 L‟ye tamamlandı. 14.2 g (0.1 mol) Na2HPO4 950 mL distile suda çözülerek, 1 N HCl ile pH‟sı 8.0‟e getirildi ve son hacim distile su ile 1 L‟ye tamamlandı.

 Proteinlerin kantitatif tayininde kullanılan çözeltiler:

Fenol ayıracı: Folin-fenol ve distile sudan bire bir oranda alınarak hazırlandı .

Ayıraç A : % 2‟lik Na2CO3 0.1 M NaOH„da çözüldü. Ayıraç B : %1 NaK tartarat distile suda çözüldü Ayıraç C : % 0.5‟lik CuSO4 distile suda çözüldü.

Ayıraç D : 48 mL A ayıracından, 1mL B ayıracından, 1mL C ayıracından konulup hazırlandı.

Sığır Serum Albumini (BSA): 5 mg 5 ml suda çözülerek taze olarak hazırlandı.

 Amonyum sülfat çöktürmesi sonucunda oluĢan çökeleğin alındığı tampon: 0,1 M Tris-Baz tamponu (pH 8.0); 1.211 g (0.01 mol) tris-Baz 95 mL distile suda çözülerek, 1N HCl ile pH‟ı 8.0‟a getirildi ve son hacim distile su ile 100 mL‟ye tamamlandı.

 Substrat çözeltisi: 2 mM paraokson çözeltisi; 10.8 l paraokson, 1 mL asetonda iyice çözüldükten sonra üzerine 1 mL bazal aktivite tamponu eklendi ve iyice karıĢtırıldıktan sonra kullanıldı.

 Paraoksonaz aktivite ölçümünde kullanılan bazal aktivite tamponu: 2 mM CaCl2 içeren 100 mM tris-HCl, pH=8; 3.0285 g (25 mmol) Tris, 200 mL distile suda çözüldü. 1 N HCl ile pH‟ı 8.0‟e getirildi. 0.0555 g (0.5 mmol) CaCl2 katılarak son hacim 250 mL‟ye tamamlandı.

 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan numune tamponu;

0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 2.5 mL % 10‟luk SDS 4.0 mL Gliserol 2.0 mL β-merkaptoetanol 1.0 mL Bromfenol mavisi 0.01 g Distile su 0.5 mL

 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan tank tamponu;

Tris-HCl 3 g

Glisin 14.4 g

 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan ayırma ve yığma jellerinin hazırlanıĢı; SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan jel karıĢımlarının hazırlanıĢı ve kullanılan miktarları Çizelge 2.1‟de verilmektedir.

 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan renklendirme çözeltisi; 0.66 g Coomassie brillant blue G-250, 120 mL metanolde çözüldü. Bu çözeltiye 24 mL saf asetik asit ve 120 mL distile su ilave edildi.

 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan renk açma çözeltisi; Hacimce % 7.5 asetik asit, % 5 metanol ve % 87.5 mL distile su içermektedir. Bu amaçla 75 mL asetik asit ve 50 mL metanol, 875 mL saf su ile karıĢtırıldı.

Çizelge 2.1. SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan jel karıĢımlarının miktarları.

Ayırma Jeli Yığma Jeli

%10 %3

Akril amid/Bis

Akril amid 15 g Bis 0.4 g

Alınarak son hacim distile su ile 50 mL'ye tamamlanır.

16.65 2.6 mL

Distile su 20.1 mL 12.2 mL

1.5 M tris-HCL (pH 8.8) Tris-HCI 11.82 g

Alınarak pH 8.8 oluncaya kadar 0.1 M NaOH ilave edilerek son hacim distile su ile 50 mL'ye tamamlanır.

12.5 mL _

0.5 M Tris-HCI (pH 6.8) Tris-HCI 3.94 g

Alınarak pH 6.8 oluncaya kadar 0.1 M NaOH ilave edilerek son hacim distile su ile 50 mL'ye tamamlanır.

_ 5 mL

% 10 'luk SDS SDS 1g

Alınarak son hacim distile su ile 10 mL'ye tamamlanır.

0.5 L 200 L

TEMED 25 L 20 L

%10'luk amonyum persülfat Amonyum persülfat 1g

Alınarak son hacim distile su ile 10 mL'ye tamamlanır.

 Sinyal moleküllerinin hazırlanıĢı için kullanılan tamponlar:

1 mM CaCl2 içeren 100mM HEPES tamponu (pH 7.4); 6.507 g HEPES 200

ml distile su içerinde çözüldü. 1 N HCl ile pH‟ı 7.4‟e getirildi. 0.011 g CaCl2 katılarak son hacim 250 mL‟ye tamamlandı.

1 mM CaCl2 içeren 100mM tris HCl tamponu (pH 7.4); 0.06057 g tris HCl 80 ml distile su içerinde çözüldü. 1 N HCl ile pH‟ı 7.4‟e getirildi. 0.011 g CaCl2 katılarak son hacim 100 mL‟ye tamamlandı.

 Gram boyama için kullanılan çözelti : %0.5’ lik Kristal viyolet; 1.25 g kristal viyolet 250 ml distile su içerisinde çözülerek hazırlandı. Her bir kullanımdan önce filtre kağıdından süzüldü .

 HPLC Çözeltilerinin HazırlanıĢı: Kullanılan elüsyon çözeltileri A (% 0.2 asetik asit), B (% 20 distile su), C (% 80 asetonitril)‟dir.

 Tetrazolyum viyolet metabolizma indikatörü: 0.04 g iodo nitrotetrazolyum viyolet 5 ml steril distile suda çözülerek hazırandı.

 Serum Fizyolojik HazırlanıĢı: 4 g NaCl, 1 l distile suda çözülerek hazırlandı. Daha sonra falcon tüplere paylaĢtırılarak 20 dk 121ºC‟de steril edildi. Ġnokulum süspansiyonunun hazırlanıĢı iĢleminde kullanıldı.

 Ġnokulum Süspansiyonunun HazırlanıĢı: Antibakteriyal aktivitede bakteri süspansiyonları serum fizyolojik ile MacFarland 0.5 standardına göre hazırlandı. Aynı zamanda spektrofotometre ile 600 nm‟de 0.5 absorbans değeri okunarak doğruluğu teyit edildi.

Katı kültürden inokulum hazırlanırken Middlebrook 7H9‟da süspanse edilen örnek vortekslendikten sonra katı parçacıkların çökmesi beklenerek üstte kalan süpernatant kısmı steril tüpe aktarıldı. MacFarland 0.5 oluncaya dek gözle ayarlama yapıldı. Daha sonra 1 ml alınıp 4 ml serum fizyolojik ile sulandırılarak inokulum süspansiyonu hazırlandı.

 Luria-Bertani (LB) Broth ve Agar Besiyerlerinin Hazırlanması: LB besiyeri Sambrook ve ark., 2001 protokolüne göre hazırlanmıĢtır. 1000 ml saf su içerisinde 5 g NaCl, 10 g triptone ve 5 g yeast extract (maya özütü) çözündürülerek pH‟sı 7.5 olarak ayarlanmıĢtır. Hazırlanan LB 15 dakika 121ºC‟de sterilize edilmiĢtir. Hazırlanan LB besiyerine % 1.5 bacto agar eklenerek katı besi ortamları hazırlanmıĢtır.

 Tryptic Soy Broth (TSB) Besiyerinin HazırlanıĢı: Besiyeri, 30.0 g/L olacak Ģekilde distile su içinde eritilir. Amaca uygun Ģekilde tüplere ve/ veya erlenlere dağıtılıp, otoklavda 121°C'da 15 dakika sterilize edilir. HazırlanmıĢ besiyeri berrak ve sarımsı renktedir. Otoklav sonrası 25°C'da pH'sı 7.3±0.2 olacak Ģekilde muhafaza edilir.

 Nutrient Broth ve Agar Besiyerlerinin HazırlanıĢı: Besiyeri, 8.0 g/L olacak Ģekilde distile su içinde eritilir ve amaca uygun kaplara (tüp, erlen vs.) dağıtılır. Otoklavda 121°C'da 15 dakika sterilize edilir. HazırlanmıĢ besiyeri berrak ve sarımsı renkli olup, 25 °C'da pH'sı 7.0±0.2 olacak Ģekilde muhafaza edilir.