As alterações no envelhecimento de cada indivíduo podem ser igualmente influenciadas pela genética e fatores ambientais e é necessário saber de que modo os genes e seus produtos interagem para entender a contribuição deles ao organismo e ao fenótipo apresentado. Um conjunto genotípico adaptado a uma determinada fase do ciclo da vida pode se tornar comprometedor em outra etapa, mas a capacidade adaptativa produzida por todas essas características é que determina a aptidão de um indivíduo (HERSKOWITZ, 1977). O modelo experimental do estudo da influência da Hsp65 no processo de envelhecimento consiste de camundongos geneticamente selecionados da Seleção III para expressar alta (HIII)
ou baixa (LIII) produção de anticorpos. A característica fenotípica escolhida para obtenção das
linhagens HIII e LIII, a partir do intercruzamento de quatro populações distintas de
camundongos geneticamente heterogêneos Swiss (SIQUEIRA et al., 1976), foi a resposta secundária, máxima ou mínima, a antígenos flagelares de Salmonella, seguindo cruzamentos em gerações sucessivas de animais apresentando os fenótipos extremos após imunizações alternadas com os antígenos não cross-reativos de S. entérica sorotipo Typhimurium e sorotipo Oranienburg, evitando-se, assim, a interferência de anticorpos maternos passivamente transmitidos à prole. O cruzamento bidirecional dos camundongos que apresentavam alta ou baixa resposta de anticorpos levou à divergência progressiva dos fenótipos durante 16 gerações sucessivas, quando se atingiu a homozigose dos grupos de genes que controlam o fenótipo (BIOZZI et al., 1979).
A pressão seletiva bidirecional exercida em cada linhagem resultou no acúmulo de alelos em múltiplos loci (loci de características quantitativas / quantitative trait loci [QTL]) dotados de ações distintas sobre as diferentes etapas de regulação da biossíntese de anticorpos. Estudos genéticos determinaram que a característica “produção quantitativa de anticorpos” está sob o controle poligênico de 5 a 10 loci independentes (REIS et al., 1992; SANT'ANNA et al., 1982). Esses animais são homozigotos apenas nos genes relacionados à produção de anticorpos, e heterogêneos no restante do seu genótipo como a linhagem original. O mapeamento gênico nas linhagens HIII e LIII demonstrou QTLs altamente significantes
ligados à produção de anticorpos contra o antígeno flagelar de Salmonella nos cromossomos 3 e 9, relacionados pela primeira vez à regulação da resposta de anticorpos, e no cromossomo 8, também descrito na Seleção I (DE SOUZA et al., 2004; PUEL; MOUTON, 1996). Ressalta-se que os camundongos da Seleção III apresentam resposta multiespecífica, diferindo na resposta a antígenos não relacionados aos utilizados durante o processo de seleção, o que indica uma modificação geral no mecanismo de síntese de imunoglobulinas (SANT'ANNA et al., 1991).
Porém, apesar de direcionados para uma resposta máxima ou mínima de anticorpos, o processo de seleção levou ao aparecimento de outras características fenotípicas nas linhagens da Seleção III, dentre elas a relação inversa entre a produção de anticorpos e a quantidade de heparina; o fato de essas duas linhagens apresentarem distribuição inversa da produção de heparina e os níveis de anticorpos sugere que essa relação não ocorre ao acaso. A heparina, que possui função anticoagulante, anti-homeostática, inibidora de enzimas, atividade antibactericida e ação antiviral, pode agir alternativamente como mecanismo de vigilância do organismo contra alguns patógenos (STRAUS et al., 1984). Essas linhagens também representam um modelo adequado para investigar fatores genéticos e ambientais atuantes no sistema imunológico inato e adquirido em estudos de resistência ou susceptibilidade a patógenos, toxinas, tumores e autoimunidades. Em relação à tumorigênese, camundongos bons respondedores (Seleções I, III e G) são mais susceptíveis ao tumor de pele iniciado com 7,12-dimetilbenz[α]antraceno [DMBA] e promovido com 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato [TPA] que os maus respondedores; essa observação sugere que a resistência a esse carcinoma de pele pode estar geneticamente relacionada com os genes de baixa resposta de anticorpos (IBANEZ et al., 1999). Outras pesquisas mostraram a susceptibilidade à artrite, nos quais HIII são resistentes e LIII extremamente vulneráveis a atrite
induzida por pristane. Nesse estudo foi indicada a colocalização de genes nos cromossomos 1, 6, 9 e 12 responsáveis pela produção de anticorpos e a susceptibilidade da doença (JENSEN et al., 2006). Um fator importante para o desenvolvimento desses estudos de envelhecimento é o tempo médio de sobrevida que, na Seleção III, é semelhante entre HIII (611 ± 153 dias de
vida) e LIII (622 ± 166 dias de vida) (DORIA et al., 1997).
Vários fatores associados à imunosenescência durante o processo de envelhecimento ainda não estão esclarecidos como a possibilidade de herança de genes associados tanto a longevidade quanto a regulação do sistema imune (PELLICANO et al., 2013), e a forma diferencial como a imunosenescência ocorre no gênero masculino e feminino (GAMEIRO; ROMAO, 2010; HIROKAWA et al., 2013; MARTTILA et al., 2013). Assim, visando a maior
compreensão do processo de imunosenescência, utilizaremos as linhagens da seleção III para o estudo da influência da Hsp65 no sistema imune durante o processo de envelhecimento.
2 JUSTIFICATIVA
Fundamentado nas relações já estabelecidas das proteínas de choque térmico e autoimunidades, nosso grupo verificou que a Hsp65 de M. leprae participa na redução da sobrevida de fêmeas lúpicas F1(NZBxNZW), induzindo a produção de anticorpos anti-Hsp65
e anti-DNA e participando na mudança do balanço Th1/Th2. Baseando-se nas alterações imunes e na observação de processos crônico-degenerativos em indivíduos idosos, investigamos se há influência da Hsp65 na produção de anticorpos e nas alterações do envelhecimento. Observamos durante o mestrado que a inoculação intraperitoneal da Hsp65 induziu redução do TMS em fêmeas HIII velhas (9 meses); esse efeito também foi observado
em fêmeas HIII adultas (4 meses), mas em menor intensidade. Contudo, diferentemente do
observado em camundongos lúpicos, a produção dos isótipos IgG1 e IgG2a em fêmeas HIII
não se modificou. Os resultados indicaram a interferência efetiva da Hsp65 na sobrevida de fêmeas envelhecidas constitutivamente boas respondedoras, porém, não vinculada à produção de anticorpos. Como o mecanismo de ação da Hsp65 no desenvolvimento e evolução de processos crônico-degenerativos é pouco conhecido, sugerimos que a proteína tenha efeito pleiotrópico no sistema imune. Considerando que em indivíduos envelhecidos o sistema imune já se encontra modificado, a Hsp65 poderia exacerbar as alterações agindo em componentes da imunidade inata e adaptativa e no recrutamento e ativação celular. Não desconsideramos que o efeito observado seja, eventualmente, influenciado pelo método de seleção das linhagens HIII e LIII e influenciado pela constituição genética de cada uma delas,
uma vez que são susceptíveis à indução de doenças autoimunes. No presente estudo, levantamos a hipótese que a administração da Hsp65 conduza a alterações das células imunes envolvidas na resposta anti-Hsp65 em fêmeas HIII e que essa susceptibilidade seja devida a
3 OBJETIVOS
Identificar a influência da administração passiva da Hsp65 de M. leprae no sistema imune de fêmeas HIII envelhecidas através da análise das possíveis alterações nos padrões
celulares no baço e no sangue periférico, além da ativação de linfócitos T e B. Para evidenciar um possível componente genético relacionado à susceptibilidade à Hsp65 realizaremos a análise comparativa dos níveis de anticorpos IgG e IgM, da fenotipagem celular e do TMS, em camundongos híbridos F1H e F1L (obtidos de cruzamentos recíprocos das linhagens HIII e
4 MATERIAL E MÉTODOS