Kromatografik Ayırmalar

Kromatografi, moleküller veya iyonlar halindeki karışımların hareketli (mobil) bir faz yardımıyla sabit (stationary) bir faz üzerinde değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanarak birbirinden ayrılması olayı olarak tarif edilmektedir. Kromatografi kompleks karışımlarda bulunan yapı bakımından birbirine yakın özellikteki maddeleri ayırmak için kullanılan oldukça faklı yöntemleri içerir. Bütün kromatografik ayırmalarda numune gaz, sıvı veya süperkritik akışkandan meydana gelmiş hareketli faz yardımı ile taşınır. Kromatografi olayında, adsorpsiyon, dağılma, iyon değiştirme ve geçirgenlik gibi kuvvetler rol oynar (Skoog, D.A.,1998).

1.13.4.1. Kolon kromatografisi

Adsorpsiyon ve dağılma kromatografileri kolon kromatografi işlemine örnek olarak gösterilmektedir. Bu tür ayrıma işlemi için önce kolonun hazırlanması gerekir. Farklı dolgu maddelerinden seçilen kolonun doldurulması gerekir ve uygun çözücü ortamında hazırlanmış hedef maddeyi içeren çözelti sürekli olarak kolona gönderilir. Kolona çözücünün sürekli verilmesi, hareketli ve durgun faz arasında sürekli madde aktarımı yaparak, çözünen madde moleküllerini kolonda aşağı doğru taşır. Durgun faz tarafından kuvvetli bir şekle tutulan maddeler kolondan çıkan çözeltide küçük bir miktarda olmaktadır.

Kolon dolgu maddesi olarak; magnezyum oksit, magnezyum karbonat, kalsiyum karbonat, alüminyum oksit, sakkaroz, silika jel, talk, aktif karbon, odun kömürü, çinko oksit, nişasta, tabii ve sentetik iyon değiştiriciler başta olmak üzere farklı maddeler kullanılabilir. Bunun yanında hareketli faz olarak ise, su, alkol, aseton, kloroform, benzen, toluen, amonyak gibi sıvılar ile bunların bazı karışımları kullanılabilmektedir. Sabit faz kolona; kuru ve ıslak doldurma olmak üzere iki şekilde doldurulabilir. Islak doldurma da, sabit faz kolona bir çözücü yardımı ile

doldurulurken kuru doldurma da sadece kolona yanlarından vurarak katı faz kolona yerleştirilir. Bu işlemden sonra kolon çözücü ile ıslatılabilir.

1.13.4.2. Yüksek performanslı sıvı kromatografi

(HPLC)

Sıvı kromatografisi bir ayırma metodudur ve bütün sıvı kromatografisi türleri numuneyi oluşturan bileşiklerin sabit faz üzerinden farklı hızlarda göç etmeleri ile ayrılmalarına dayanır. Çözelti ortamında çözünmüş halde bulunan birden fazla bileşik kolona doldurulmuş olan sabit faz ile etkileşmeleri sonucunda kimyasal özelliklerine bağlı olarak farklı hızlarda ilerlerler ve kolonu farklı zamanlarda terk ederler. Bu şekilde ayırma işlemi tamamlanmış olur. Bu kromatografi metodu uzun yıllar öncesinden bilinmektedir ancak, bulunan yeniliklerle beraber günümüzde daha gelişmiş özelliklere sahip kromatografi teknikleri mevcuttur.

Yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) metodu gelişmiş sıvı kromatografisine örnek olarak verilmektedir. Bu metotta, hareketli sıvı faz kolona farklı çalışma hızlarında ayarlanması mümkün olan pompalar ile gönderilir. Bu sayede ayırma işlemi daha kısa sürede tamamlanabilmektedir. Diğer kromatografi teknikleri ile kıyaslandığında bileşiklerin sadece %20 civarında bir kısmı gaz kromatografisi ile analiz edilebilmektedir. Bunun sebebi, bileşiklerin ya termal olarak sağlam özellik göstermemesi ve ayırma sırasında bozunabilmesi ya da yeterli oranda buharlaşmaması ve kolondan geçmemesidir. Ayırma işlemleri için HPLC metodu kullanıldığı zaman ise bileşiğin buharlaşma oranı veya termal sağlamlığı sınırlandırılmamıştır. Bunun yanında HPLC ile makromoleküller ve iyonik türlerin, doğal ürünlerin, polimerik materyallerin ve diğer pek çok yüksek molekül ağırlığına sahip polifonksiyonel grupların analizi yapılabilmektedir. HPLC metodu ayırma işlemleri için çeşitli seçimli etkileşimlere izin veren çok çeşitli sabit fazları

bulundurabilmektedir ve numunelerin geri kazanımı oldukça kolay olmaktadır (Willard ve ark., 1988).

HPLC, bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır. Yöntemin bu kadar yaygın olmasının sebepleri; hassasiyeti, doğru kantitatif tayinlere kolayca uygulanabilir olması, uçucu olmayan türlerin veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen türlerin ayrılmasına uygun olması ve sanayinin ve birçok bilim dalının önemli derecede ilgilendiği amino asitler, proteinler, nükleik asitler, hidrokarbonlar, karbonhidratlar, ilaçlar, terpenoidler, pestisidler, antibiyotikler, steroidler, metal- organik türler ve çeşitli inorganik bileşikler gibi maddelere geniş bir şekilde uygulanabilir olmasıdır.

1.13.4.2.1. HPLC cihazının kısımları

Bir sıvı kromatografi sisteminde genel olarak kullanılan tanecik boyutu 2 ile 10µm arasında olan dolgu maddeleri ile uygun sıvı akış hızları elde edebilmek için yüksek pompa basıncına gerek vardır. Bu yüksek basıncın bir sonucu olarak HPLC için diğer tip kromatografi sistemleri ile karşılaştırıldığında daha ince bir işçilik gerektirmektedir. HPLC cihazı her biri 200-1000mL çözücü içeren bir veya daha fazla cam veya çelikten yapılmış hareketli faz hazneleri içermektedir. Bu hazneler, kolonda ve dedektör sisteminde gaz oluşturarak bozucu etkilere sebep olan çözünmüş gazların giderilmesi için bir cihazla donatılmıştır.

HPLC cihazında bulunan diğer bir kısım pompalama sistemleridir. Pompalama sistemleri için gerekli şartlar sağlanmalıdır. Örneğin, 400 atm e kadar basınç üretimi, puls içermeyen basınç çıkışı, 0,1-10 mL/dakika aralığında akış hızları, %0,5 veya daha iyi bir bağıl tekrarlanabilirlik ile akış kontrolü, korozyona dayanıklı parçalar bir HPLC cihazında bulunması gereken özelliklerdir. Pompalama sistemleri farklı türlerde olabilmektedir ve her birinin kendine göre avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır.

Numune enjeksiyon sistemleri HPLC cihazının diğer bir kısmıdır. 5µL den 500µL ye

mikro numune enjeksiyon musluğu kullanılarak 0,5-5 µL numune ile çalışma yapılabilmektedir.

Sıvı kromatografi kolonları düzgün iç çaplı, paslanmaz çelik borulardan yapılır, ancak ara sıra cam borular da bu sistemde kullanılabilmektedir. Çeşitli üreticilerden boyutları ve dolgu maddeleri farklı yüzlerce çeşit dolgu kolonu temin etmek mümkündür.

Dedektörler cihazın son kısmını oluşturmaktadır. Genel olarak günümüzde

dedektörlerin sahip olması gereken özellikler; İyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik Geniş bir doğrusal çalışma aralığı

Akış hızından bağımsız kısa cevap zamanı Yüksek güvenilirlik ve kullanım kolaylığı

Bant genişlemesini azaltmak amacı ile minimum iç hacme sahip olması, olarak sıralanabilir. Farklı türlerde dedektörler mevcuttur.

Sıvı kromatografi kolonun için kullanılan dolgu maddelerinin büyük bir kısmı için kullanılan destek katıları silis veya silis esaslı bileşimlerden hazırlanmaktadır. Bu katılar 3,5 veya 10µm çapında, mekanik olarak dayanıklı yapılardır. Hidroliz edilmiş bir silis yüzeyi kimyasal olarak reaktif silanol gruplarından meydana gelmiştir. Hidrolizlenmiş bu yüzeylerin organosilan bileşikleri ile reaksiyonundan elde edilen siloksanlar en kullanışlı kolon destek maddeleridir (Skoog, D.A., 1998)