Kristalizasyon Ve Distilasyon Yöntemi Ġle DHA ZenginleĢtirilmesi

Stout ve arkadaĢlarının incelemesine göre balık yağı yağ asitlerinden EPA ve DHA’in zenginleĢtirilmesi için düĢük sıcaklık kristalizasyonu olumlu sonuç vermektedir [88,89]. Literatürde balık yağının asetonlu çözeltisinin -25^oC de soğutulmasıyla çöken kristallerin ayrılması ile ele geçen filtratta EPA’nın konsantre olduğu , yine asetonlu çözeltinin -40oC ye soğutulması halinde ise EPA ve DHA’in birbirinden ayrılabildiği sonuçlarının sunulduğu çalıĢmalar yer almaktadır [20,89,90].

EPA ve DHA doymuĢ veya teklidoymamıĢ etil esterlerden distilasyon yöntemi ile ayrılabilirler. Bu konuda yapılan araĢtırmaların birinde balık yağı ve etanol karıĢımına enzim ilave edilerek manyetik karıĢtırıcıda oda sıcaklığında 50 saat karıĢtırılarak hidroliz edilir. Lipazı bu karıĢımdan ayırmak için elde edilen bu ürün santrifüj de (5000 rpm, 10 dakika) tutulur. Daha sonra ayrılan kısım 80^oC de vakum altında distilasyon ile degase edilir bu esnada uçucu bileĢenlerin ayrılarak ester karıĢımının oluĢması sağlanır. Bu karıĢım 125o

C, 0.005 mbar da distilasyona tabi tutularak DHA ve EPA’ca zengin fraksiyon elde edilir [78].

Ancak bu proses koĢullarında doymamıĢlık derecesi yüksek olan omega 3 çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin termal polimerizasyonunun önüne geçilemediği de vurgulanmıĢtır [78].

3.5.5 Enzimatik Hidroliz ve EsterleĢme Yöntemi ile DHA ZenginleĢtirilmesi

Omega-3 yağ asitlerinden Dokosahekzaenoik asidin insan sağlığına pek çok olumlu etkisinin olduğu ortaya çıkarıldıktan sonra balık yağların da bolca bulunan bu maddenin zenginleĢtirilerek elde edilmesi için pek çok metotlar denenmiĢtir. Özellikle son 20 yıldır üzerinde en çok durulan metotlardan biri de enzimatik hidroliz yolu ile balık yağlarının DHA açısından zenginleĢtirilmesidir. Lipazın seçici ve spesifik olması yağların DHA bakımından zenginleĢtirilmesin de önemli bir etkiye sahiptir [91,92].

Çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin konsantre edilmiĢ formlarının tüketilmesinin direk balık tüketiminden daha faydalı olduğunun anlaĢılması üzerine çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin zenginleĢtirilmesinde kullanılabilecek pek çok metot geliĢtirilmiĢtir. Distilasyon, kromatografi, üre ile fraksiyonlama, süperkritik CO2 ve enzimatik hidroliz bunlardan bazılarıdır. Ancak enzimatik hidroliz yönteminin diğer yöntemlere

nazaran daha avantajlı olduğu görülmüĢtür. Bu yöntem cis-omega 3 çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin oksidasyon ile kısmi zarar görmesine, cis-trans izomerizasyonuna veya çift bağın yer değiĢimine sebep olacak kadar uç noktalarda pH ve yüksek sıcaklık kullanımı gerektirmez. Diğer metotlara kıyasla enerji tasarrufu sağlar ve ürün seçiciliğini arttırır. Enzimatik hidroliz yöntemi ile acylgliserol formunda omega 3 yağ asitleri elde edilir, bu da beslenme açısından metil veya etil esterlere göre daha çok tercih edilir [93].

Yağların enzimatik hidrolizi ile DHA mono, di ve trigliseridler içinde zenginleĢtirilir. Hidroliz reaksiyonu boyunca mono, di ve trigliserid yüzdeleri değiĢir. Hidroliz iĢlemi sonunda elde edilen ürün ekstrakte edilerek serbest yağ asitleri ortamdan uzaklaĢtırılır ve monogliserid, digliserid ve trigliserid’lerden oluĢan gliserid karıĢımı elde edilir. Elde edilen bu karıĢımdan ekstraksiyon çözücüsü evaporasyonla uzaklaĢtırıldıktan sonra karıĢım esterleĢtirilerek gaz kromatografide analiz yapılır. Gaz kromatografisi yağ asitlerinin analizinde kullanılan vazgeçilmez bir tekniktir. YaklaĢık yarım asırdır yağ asitlerinin analizinde en çok tercih edilen metottur. James ve Martin tarafından serbest yağ asitlerinin ilk kez ayrılmasının ardından birkaç yıl içinde gaz kromatografi metodu yağ asitlerinin küçük ölçekli çalıĢmalar ile pek çok alanda incelenmesinde çok uygun bir metot olarak görülmüĢ ve yaygın bir Ģekilde kullanılmaya baĢlanmıĢtır [94]. Yapılan pek çok çalıĢma sonunda hidroliz reaksiyonunda etkili olan faktörlerin sıcaklık, ortam pH’ı, enzim türü ve miktarı, su miktarı ve karıĢtırma hızı olduğu görülmüĢtür [95,96].

Tamatsu Hoshino, Tsuneo Yamane ve Shoichi Shimizu 1989 yılında altı değiĢik lipaz kullanarak yaptıkları deneylerle Morina balığının karaciğer yağını DHA bakımından zenginleĢtirmeye çalıĢmıĢlar ve sıcaklığın hidroliz ile DHA bakımından konsantre ürün elde edilmesine etkilerini incelemiĢlerdir. Sonuç olarak Candida cylindracea ve Aspergillus niger lipazının orijinal yağa göre hidroliz ürünününde 2 kat daha fazla DHA eldesini sağlayarak diğer lipazlardan daha etkili olduğunu görmüĢler. Ancak Aspergillus niger lipazının sadece DHA’ı değil beraberinde EPA ve DPA (dokosapentaenoik asit) artıĢına da sebep olduğu anlaĢılmıĢtır. Ayrıca düĢük sıcaklıklarda lipaz aktivitesinin de düĢük olmasına bağlı olarak DHA zenginleĢtirilmesinin yeterince iyi olmadığı ancak kötü koku oluĢumunun engellendiği görülmüĢtür [97].

Yuji Shimada ve arkadaĢları ton balığıyağını 30o

C de, 16 saatte değiĢik lipazlar kullanarak (Candida cylindracea, Geotricuim candium, R. delemor ve F. heterosporum) hidroliz etmiĢler ve Candida cylindracea lipazı ile gerçekleĢtirilen hidroliz sonunda %48.7 oranında DHA ve EPA içeren ürün elde etmiĢlerdir. Elde edilen bu ürünün ekstraksiyon sonrası ikinci kez aynı lipaz ile hidrolizi sonucu bu oran %58.7’ye yükseltilebilmiĢtir [98].

1990 yılında Matthew J.Hills ve arkadaĢları çalıĢmalarında bütanol ile lipaz katalizörlüğünde seçici esterleĢtirme yöntemini kullanarak morina balığının karaciğer yağı ile denemeler yapmıĢlardır. Küçük Ģalgam fidesinden elde edilen lipaz (Brassica rapus cx Ceres) ve Mucor miehei’den elde edilen lipaz (Lipozyme) kullanılarak DHA bakımından zenginleĢtirme yapıldığında 48 saat sonunda Ģalgam fidesi lipazı ile yapılan çalıĢmalarda yağ asitleri içinde DHA miktarının %9.4’ten %16.6’ye yükseldiği görülmüĢtür. Lipozyme ile yapılan çalıĢmalarda ise 16 saat sonunda bu değerin yaklaĢık %54’e yükseldiği belirtilmiĢtir [99].

Yukihisa Tanaka ve arkadaĢlarının 1992 yılında yayınlanan makalelerinde DHA’in gliserid karıĢımı (mono, di, trigliserid) içinde konsantre edilmesine yönelik çalıĢmalarına yer verilmiĢtir. Bu çalıĢmalarda Tanaka ve arkadaĢları altı çeĢit lipaz (Candida cylindracea, Aspergillus niger, Pseudomonos sp., Rhizopus delemar, Chromobacterium viscosum, Rhizopus javanicus) kullanarak Ton balığını 37^oC’de 500devir/dakika’da 40 saat süre ile hidroliz etmiĢlerdir. Elde edilen ürünü ekstrakte ettikten sonra ekstraksiyon solventini uçurup BF3-MeOH ile esterleĢtirerek gaz Kromatografi cihazında analiz etmiĢlerdir. Sonuç olarak Candida cylindracea lipazı ile gliserid karıĢımı içindeki DHA miktarı orijinal yağa oranla 3 kat arttırılırken diğer lipazların gliserid karıĢımı içinde DHA zenginleĢtirmesi yapmadığı görülmüĢtür [100].

Ton balığından DHA’ce zengin ürün elde edilmesi için Yuji Shimada ve arkadaĢlarının yaptığı diğer çalıĢmalarda da ton balığı önce NaOH-etanol çözeltisinde hidroliz edilmiĢ ve elde edilen yağ asidi karıĢımı daha sonra Rhizopus delemar lipazı kullanılarak 30^oC’de 500 devir/dakika hızda karıĢtırılarak esterleĢtirilmiĢ ve gaz kromatografide analiz edilmiĢtir. Analiz sonrası DHA’in ağırlıkça %23’den %65’e zenginleĢtirildiği görülmüĢtür [101].

Yukihisa Tanaka ve arkadaĢları DHA’in Trigliseridlerin lipaza karĢı daha dirençli olmalarını sağlayıcı bir etkisinin olup olmadığını araĢtırmıĢlardır. Candida cylindracea lipazı kullanarak ton balığını hidroliz etmiĢler ve %70 hidroliz tamamlandığında gliserid karıĢımındaki DHA miktarının orijinal yağa göre 2 kat arttığını görmüĢlerdir. Ancak DHA bakımından zengin Trigliserid ve Digliserid elde edilirken monogliseridlerin olmadığı görülmüĢtür. Ġncelemeler sonucu Candida cylindracea lipazının genel bir değiĢle trigliserid spesifik olduğu ve özellikle içerdiği DHA miktarı arttıkça lipazın trigliseridleri hidrolize etmesinin güçleĢtiği görülmüĢtür [92]. Gerek spesifik olmayan Candida cylindracea lipazı gerekse 1,3 spesifik enzimlerin kullanıldığı hidroliz reaksiyonlarında çokludoymamıĢ yağ asitlerinin trigliserid ve digliserid fraksiyonlarında konsantre olması tüm bu enzimlerin çokludoymamıĢ yağ asitlerini özellikle DHA’i hidrolize edememesi veya diğer yağ asitlerine kıyasla çok zor hidrolize edilmesi ile açıklanabilmektedir. Candida cylindracea, Rhizomucor miehei ve Amono P (pseudomonas) lipazlarının özellikle Dokosahekzaenoik aside karĢı negatif bir spesifiklik gösterdiği yapılan çalıĢmalarda kesin olarak belirlenmiĢtir [92,102-106]. AraĢtırmacılara göre bu yağ asitlerinde yağ asitlerinin üç boyutlu yapısı ve son çift bağın karboksil grubuna olan yakınlığı reaksiyonda sterik engel oluĢturmaktadır.

1997 yılında Yuji Shimada ve arkadaĢları enzimatik hidroliz sonucu elde edilen serbest yağ asitlerindeki DHA’in geri kazanımı için iki basamaklı hidroliz ve seçici esterleĢtirme yöntemini kullanmıĢlardır. Ton balığı Pseudomonas lipazı ile 400

C de 48 saat süre ile hidroliz edildikten sonra gliseridler n-hekzan ile alkali ortamda ekstrakte edilerek ayrılır, suda kalan serbest yağ asitleri ise asidik ortamda n-hekzan ile yeniden ekstrakte edilir. Elde edilen serbest yağ asitleri lauryl alkol kullanılarak Rhizopus lipazı ile 30⁰C’ de 500 devir/dakika’da 20 saatte esterleĢtirilmiĢtir ve serbest yağ asitlerindeki DHA miktarının 24%’ten 72%’ye yükseldiği görülmüĢtür. DHA miktarını daha da artırmak için elde edilen üründen serbest yağ asitleri ekstrakte edilerek yeniden esterleĢtirildiğinde bu oranın %91 e kadar ulaĢtığı görülmüĢtür. Ayrıca bu çalıĢmalarda lauryl alkol yerine kısa zincirli (metanol, etanol gibi) alkoller kullanıldığında esterleĢme veriminin düĢtüğü görülmüĢtür [107].

4. ENZĠM ve LĠPAZ HAKKINDA GENEL BĠLGĠ