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O agente etiológico causador da raiva é o vírus rábico, pertencente à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae e gênero Lyssavirus. O vírus rábico (Figura 4) possui 120-250 nm de tamanho e é composto por duas partes: um nucleocapsídeo interno helicoidal e um envelope lipídico que o caracteriza como vírus envelopado (KING et al., 2011). O material genético do vírus é composto de RNA antisense com 12 kb de comprimento que compõe cinco genes para codificação de apenas cinco proteínas: uma nucleoproteína (proteína N); uma fosfoproteína (Proteína P); uma proteína de matriz (Proteína M); uma glicoproteína (Proteína G) e uma RNA-polimerase (Proteína L). As proteínas N, P e L constituem o nucleocapsídeo e em conjunto com o RNA genômico viral formam o complexo ribonucleoproteico. As proteínas M e G envolvem o ribonucleoproteico e juntas constituem o envelope viral, como evidenciado abaixo (MASATANI et al., 2010).

As proteínas N, P e L constituem o nucleocapsídeo de forma que a proteína N (58- 62kDa) é uma fosfoproteína que apresenta alta especificidade para englobar o RNA viral e formar o complexo ribonucleoproteico de forma eficiente, o que proporciona o molde para a transcrição do RNA e a replicação pelo complexo polimerase do vírus, que incluem as proteínas P e L. A proteína P (35-40 kDa) também é uma fosfoproteína que é fosforilada por certos isômeros de proteína quinase C e apresenta a relação entre N e P de 2:1, o que sugere que por vírus, duas moléculas de N interagem com uma molécula de P. A terceira proteína do complexo que forma o nucleocapsídeo (proteína L) é uma RNA- polimerase (subunidades: 65-80 kDa e 190 kDa) e que portanto, apresenta função associada a síntese de RNA genômico viral (KING et al., 2011; KOSER et al., 2004.)

As proteínas M e G envolvem o complexo ribonucleoproteico e juntas constituem o envelope viral de forma que a proteína M, conhecida por ser a proteína de matriz, atua como uma ponte entre a membrana e o envelope viral, preenchendo o domínio citoplasmático da proteína G, que é incorporado na membrana do vírus derivado da célula

hospedeira. Essa proteína permanece na forma não fosforilada (KING et al., 2011; KOSER et al., 2004; SCHNELL et al., 2010).

Figura 4: Estrutura do vírus rábico evidenciando suas cinco proteínas principais.

Fonte: SCHNELL et al., 2010.

A proteína G, denominada RVGP é a única glicoproteína transmembranar da estrutura do vírus rábico (SCHNELL et al., 2010) e é a principal responsável por induzir a resposta imune no indivíduo (ASTRAY et al., 2013). Ela está presente no envelope do vírus, que é circundada pelo RNA negativo viral envolto pela proteína do nucleocapsídeo (ASTRAY et al., 2013) e é composta de quatro domínios distintos, sendo eles o domínio de sinal (não-estrutural), o domínio transmembranar, o domínio citoplasmático e o quarto domínio que são de fato três domínios ecto-glicosilados, expostos como trímeros projetados através da membrana na superfície viral, demonstrados na Figura 5 (KING et al., 2011). A molécula completa da glicoproteína possui 505 aminoácidos, com 44 no domínio citoplasmático, 22 aminoácidos no domínio transmembranar e os 439 aminoácidos restantes estão expostos na forma do trímero descrito. Seu peso molecular é aproximadamente 65 kDa. (GAUDIN et al., 1992).

Figura 5: Esquema demonstrando os domínios da glicoproteína do vírus da raiva.

Fonte: Sissoeff et al., 2005.

Após a infecção, a polimerase viral transcreve o RNA viral diretamente do genoma, gerando mRNAs monocistrônicos adenilados e metilados. A tradução ocorre nos poliribossomos, exceto a RVGP, que é traduzida e glicosilada na membrana do retículo endoplasmático associada aos poliribossomos (ASTRAY et al., 2013). Desse modo, com o intuito de conferir a imunidade ao indíviduo, a RVGP necessita da glicosilação como modificação pós-traducional, devendo ser oligomerizada e apresentar o sítio antigênico III, que é desenvolvido após o complexo pós-traducional de modificações (ASTRAY et al., 2013)

A glicosilação é uma modificação pós-traducional que requer uma série de etapas de processamento realizadas no retículo endoplasmático e no complexo de Golgi (MORAES et al., 2008). É a modificação que permite que os oligossacarídeos se liguem às proteínas através de uma ligação covalente, formando as glicoproteínas. Existem três tipos de glicosilação: a N-glicosilação, na qual os glicanos estão ligados em um resíduo de asparagina, na sequência consenso “Asn-Xaa-Ser/Thr”; a O-glicosilação, em que o glicano está ligado em um resíduo de serina ou treonina e a sequência consenso não pode ser determinada; a C-glicosilação, na qual a ligação ocorre com o triptofano, a qual existe poucos estudos e é limitado o conhecimento sobre sua importância biológica (PALOMARES et al., 2004).

A glicosilação é a alteração pós-traducional que apresenta maior ocorrência dentre as proteínas terapêuticas, em que 50% das proteínas humanas encontram-se na forma glicosilada. Os defeitos gerados no processo de glicosilação pode não ter efeitos nas células em cultura, porém podem ser fatais no organismo quando completo. Essa modificação pós-traducional específica é necessária por inúmeras proteínas por ser

responsável pelo reconhecimento de regiões específicas, como reconhecimento endógeno e exógeno (PALOMARES et al., 2004).

Algumas glicosilações são sutis enquanto outras são requeridas para o desenvolvimento, função e sobrevivência do organismo. Diversas funções estão relacionadas com a glicosilação, de forma específica, como as importantes funções regulatórias e estruturais, como o correto enovelamento, transporte, estabilidade, solubilidade, atividades específicas, reconhecimento de anticorpos e resistência a proteases encontradas em solução. Portanto, na produção de proteínas recombinantes que necessitam dessa modificação, a correta glicosilação é uma etapa importante do processo, pois preserva e mantém sua função biológica (WOJCZYK et al., 1998; PALOMARES et al., 2004).

Na sequência prevista da proteína RVGP encontramos três potenciais sítios aceptores para N-glicosilação, dos quais apenas um ou dois são glicosilados (GAUDIN et al., 1992). Não há dados descritos sobre O-glicosilção na proteína do vírus da raiva (WOJCZYK et al., 1998). A RVGP é a única proteína glicosilada, com oligossacarídeos de cadeia ramificada que são responsáveis por alcançar cerca de 10 a 12% da massa total da proteína (KING et al., 2011).

Outro importante parâmetro para análise da RVGP que deve ser mencionado é o controle do pH, visto que dependendo do valor, ela pode ter alteração de conformação para três diferentes estados que influenciam diretamente na atividade da proteína (GAUDIN et al., 2002), que serão explorados no item 5.1.3.