Korozyon Türleri

As análises por espectrometria de massa foram realizadas em colaboração com o Dr. Valdemir Melechco Carvalho, do Instituto Fleury de Pesquisa, com o Prof. Dr. Norberto P. Lopes (FCFRP, USP) e com o Dr. Paul Gates, da Universidade de Bristol, Inglaterra.

O método de ionização aplicado foi majoritariamente por electrospray (ESI) no modo positivo. Alguns experimentos foram também realizados por nanospray (nanoESI) no modo negativo. Diferentes espectrômetros de massas foram empregados:

(i) Triplo-quadrupolo Quattro-LC (Micromass/Waters). As análises foram

realizadas por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao espectrômetro com fluxo de 2-5 µL.min-1. O monitoramento dos íons mais abundantes foi compreendido entre m/z 150-500. Os diversos parâmetros de análises (potencial capilar, voltagens do cone, do extrator e das lentes RF) foram ajustados procurando maximizar a intensidade dos íons mais abundantes. Os espectros MS2 dos íons produtos foram adquiridos utilizando gás argônio como gás de colisão (4x10-3 mbar) com energia de colisão de 20 eV. Outros parâmetros foram: voltagem capilar: 4 kV; voltagem do cone: 35 V; temperatura capilar e de desolvatação: 80 e 250 °C, respectivamente. Nos experimentos por LC-MS em espectrômetro de massas triplo quadrupolo (Quattro-LC, Micromass/Waters) foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu composto por duas bombas LC-10AT controladas pelo módulo SCL-10Avp e como injetor o sistema 215 Liquid Handler (Gilson) equipado com uma válvula de injeção 819. Um detector DAD (SPD-10Avp) com comprimento de onda ajustado em 330 nm foi utilizado em linha. A condição cromatográfica empregada foi: Coluna Luna C18(2)

composta de 95% de uma solução de ácido fórmico a 0,1% e ácido heptafluorobutírico a 0,05% mais 5% metanol a um fluxo de 0,3 mL.min-1. Nestas análises foram utilizadas as frações F1 a F5 isoladas de G. tenuistipitata como descrito no item 3.4.1. As frações foram resuspendidas em solução de água:acetronitrila (1:1,v/v) com 0,1% de ácido fórmico nas análises por ESI no modo positivo e em uma solução de ACN:H2O (1:1, v/v) com 0,1% de trietilamina nas

análises no modo negativo (concentraçao final de 10 µg.mL-1). Nos experimentos de marcação isotópica com deutério as mesmas frações foram analisadas. Aproximadamente 0,1 mg de cada fração foi incubada com 10 mL de D2O por 24 h.

As amostras foram evaporadas em Speed Vac®, resuspendidas em água deuterada e analisadas por ESI-MS2. Este procedimento foi repetido até que houvesse a troca total dos hidrogênios lábeis (hidroxila (-OH), amino (-NH ou -NH2) ou carboxila (-

CO2H)) por deutério. Para confirmação dos dados obtidos em baixa resolução as

frações não deuteradas foram analisadas por alta resolução utilizando um espectrômetro quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF, Micromass/Waters). As voltagens da agulha e do cone foram 3,3 kV e 35 V, respectivamente. Nitrogênio foi utizado como gás nebulizador e argônio como gás de colisão com energia de colisão de 4 eV.

(ii) FT-ICR Apex 4e 7.0 Tesla (Bruker Daltonics). As amostras foram

injetadas na fonte ESI por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao espectrômetro com fluxo de 100 µL.h-1

. Os espectros de MSn foram obtidos a partir do isolamento da molécula protonada (íon precursor) usando CO2 como gás de

colisão. Em alguns casos foi necessário um duplo isolamento dos íons produtos. As condições da célula foram ajustadas para obtenção de espectros da molécula protonada com boa intensidade dentro da faixa de análise (m/z 100-500). Os

Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007

espectros de massas e os experimentos de isolamento foram obtidos com uma resolução de aproximadamente 50.000 e os espectros de MSn com resolução de 80.000. Normalmente entre 8 e 16 varreduras eram combinadas para gerar um espectro de massas com boa relação sinal/ruído e em alguns casos onde o sinal obtido foi pouco intenso cerca de 40 varreduras foram necessárias. As relações m/z obtidas quando comparadas aos dados teóricos ficaram na faixa de erro de ± 1 ppm. Nestas análises foram utilizadas as amostras isoladas segundo item 3.4.1 que foram resuspendidas em MeOH:H2O (1:1, v/v) com 0,05% de ácido fórmico numa

concentração final de 0,1 mg.mL-1.

iii) Ion trap Esquire HCT (Bruker Daltonics). Os experimentos foram

realizados por LC-MS e por inserção direta. Nos experimentos por LC-MS foi utilizado um sistema Shimadzu composto por duas bombas LC-20AD controladas pelo módulo CBM-20A com injetor automático SIL-20AC e detector DAD (SPD- M20A). O programa para a aquisição dos dados foi o “LabSolutions – LCsolution

Version 1.21 SP1”. A condição cromatográfica empregada foi a descrita na Tabela 5

(método D). Para a aquisição e análise dos dados por espectrometria de massa foi utilizado o programa “EsquireControl Version 5.3.” e o “DataAnalysis Version 3.3”. Um divisor de fluxo foi colocado em série com o espectrômetro de massas e o fluxo resultante no espectrômetro foi de 50 µL.min-1. O monitoramento foi feito entre m/z 150-400 Da utilizando os seguintes parâmetros: nebulizador: 10 psi; temperatura de dessolvatação de 250 oC; fluxo de gás do dessolvatador de 4 L.min-1; trap drive: 110%. Nestas análises foram utilizados os extratos GT-1, GB-1 e GD preparados segundo os itens 3.4.1 e 3.4.2 e os extratos de P. minimum obtidos segundo item 3.4.3. Nas análises de infusão direta as amostras foram resuspendidas em uma solução de MeOH:H2O (1:1, v/v) com 0,1% de ácido fórmico e injetadas com fluxo de

10 µL.min-1 e nas análises por LC-MS as amostras foram resuspendidas em TFA a 0.2% em água sendo que o volume injetado foi entre 5 e 20 µL. A concentração das amostras variou de 10 a 100 µg.mL-1.

(iv) Quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF) QStar-XL (Applied Biosystems). As

análises neste espectrômetro foram feitas por nanoESI no modo negativo utilizando um sistema de nanospray automático (Advion Biosciences, UK). Para as análises, 5 µL da solução era aspirada e nebulizada por chip Nanomate 400 a 1,45 V com pressão de nitrogênio de 0,4 psi. Parâmetros da fonte: 2700 V de voltagem no spray de íons, 75 V de potencial de declustering, focalizador a 280 V, nitrogênio como gás secante. As MAAs chinorina e porphyra-334 isoladas da matéria-prima Helioguard 365® foram resuspendidas em MeOH:H2O (1:1,v/v) numa concentração final de

0,1µg.mL-1

.