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Quando o objetivo é a efetiva conservação, manejo e a utilização eficiente dos recursos genéticos vegetais, ter o conhecimento da base molecular dos fenômenos biológicos torna-se crucial (MONDINI et al., 2009), sendo, para isto, utilizados os marcadores moleculares.

27 Os marcadores moleculares podem ser definidos como locos genéticos que podem ser facilmente rastreados e quantificados em uma população, podendo estar associados com um gene em particular ou um traço de interesse (HAYWARD et al., 2015). Este tipo de marcador proporciona a detecção de genótipos superiores, o acesso a diversidade genética dentro de cultivares e germoplastmas, o exame da genética de espécies ameaçadas de extinção, a realização de análises de sistemas de cruzamento, de eventos gargalos e análises de outras características que podem afetar os padrões de diversidade genética (RAO e HODGKIN, 2002; OLIVEIRA et al., 2006; KORDROSTAMI e RAHIMI, 2015).

Devido a sua sensibilidade e especificidade, o uso de marcadores moleculares é cada vez mais frequente e baseia-se na ocorrência natural de polimorfismos no DNA (KUMAR et al., 2009; JINGURA e KAMUSOKO, 2015). O seu uso é o meio mais efetivo para o entendimento da base da diversidade genética (de VICENTE e FULTON, 2003).

Entre as vantagens da utilização dos marcadores moleculares, estão a obtenção de polimorfismos genéticos, identificação direta do genótipo sem a influência do seu ambiente, possibilidade de detecção de polimorfismos independente do status fenológico da planta e, no caso de marcadores codominantes, possibilidade de gerar maior quantidade de informação genética por loco (FALEIRO, 2007).

Com a descoberta da técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR- Polymerase Chain Reaction) nos anos 80 por Kary Mullis, marcadores de DNA como RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats) ou microssatélites, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged

Sites), CAPS (Cleaved Amplified Polymophic Sequence) ou PCR-RFLP, SSCP (Singe-

Strand Conformation Polymorphism), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), PCR- sequencing e SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) surgiram (COUTINHO et

al., 2006).

A PCR consiste na replicação enzimática do DNA em laboratório a partir de pequenos fragmentos sintéticos de nucleotídeos, denominados primers, complementares as sequências específicas que flanqueiam a região-alvo a ser amplificada (COUTINHO et al., 2006; SARTORETTO e FARIAS, 2010). Em todos os casos, a amplificação do DNA via PCR irá produzir múltiplas bandas que servirão para indicar a presença ou ausência de variação entre indivíduos (SCHLÖTTERER, 2004).

28 Marcadores codominantes, como RFLP, CAPS, SSCP e os microssatélites permitem fazer distinção entre os locos em heterozigose dos locos em homozigose (FALEIRO, 2007).

3.6.1. Marcadores Microssatélites

Também chamados de SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats), marcadores moleculares microssatélites são formados por sequências curtas de 1-6 bases nitrogenadas repetidas em “tandem” (ANTIQUEIRA, β01γ). Codominantes, multialélicos em uma população e bialélicos em um indivíduo, constituem fração considerável do DNA não-codificante e são menos encontrados em regiões codificadoras de proteínas (YOU-CHUN et al., 2002; WAN et al., 2004; MIAH et al., 2013), representando regiões instáveis do genoma distribuídas aleatoriamente (ANTIQUEIRA, 2013). Podem ser encontrados tanto em eucariotos como em procariotos.

Marcadores microssatélites têm sido amplamente utilizados em estudos de genética de populações vegetais (CHASE et al., 1996; JADWISZCZAK et al., 2012; CRUZ NETO et al., 2014; LAVOR et al., 2014; TANAKA et al., 2014), se mostrando ferramentas extremamente eficientes. Sua frequência é negativamente correlacionada ao tamanho do genoma (MORGANTE et al., 2002) e podem ser classificados como repetições mono-, di-, tri-, tetra- e hexanucleotídicas (WANG et al., 2009; MIAH et al., 2013). De acordo com o tipo de sequência repetitiva podem ser: perfeitos, sem interrupções na sequência, e.g., (AT)20; imperfeitos, quando existe interrupção por diferentes nucleotídeos que alteram o padrão do motivo repetitivo, por exemplo, (AT)12GC(AT)8; e compostos, onde existem dois ou mais motivos in tandem, por exemplo, (AT)7(GC)6 (HOSHINO et al., 2012). Em humanos e mamíferos, a repetição mais abundantes é a do dinucleotídeo CA, ao passo que em plantas são os motivos AT/TA (KALIA et al., 2011).

A alta variação genética em muitos locos microssatélites caracteriza- se pela alta heterozigosidade e presença de alelos múltiplos e, por ser um marcador seletivamente neutro, o grau de polimorfismo dos microssatélites é proporcional à taxa de mutação, que é estimada ser de 10-2 _{a 10}-4 _{por geração (ELLEGREN, 2004; MIAH et al.,} 2013). As mutações podem ser explicadas por erros durante a recombinação, crossing-over desigual e slippage (escorregamento) da polimerase durante recombinação ou reparo (OLIVEIRA et al., 2006).

29 Quanto à origem, é sugerido que microssatélites podem surgir espontaneamente através de eventos de inserções ou deleções que duplicam as sequências adjacentes, inicialmente formando proto-microssatélites ou através de elementos transponíveis, que inserem formas primitivas de microssatélites em localizações receptivas do genoma (ZHU et al., 2000; WILDER e HOLLOCHER, 2001; KALIA et al., 2011).

A amplificação dos microssatélites é feita por primers ou iniciadores específicos, que complementam as regiões que os flanqueiam e cada segmento que é amplificado pode ter um tamanho diferente, correspondendo a um diferente alelo do mesmo loco (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998; WAN, et al., 2004). Seus principais atributos são fácil detecção pela reação de cadeia da polimerase (PCR), alto nível de diversidade alélica, natureza multialélica, codominância, alto nível de polimorfismo intraespecífico no loco, relativa abundância, cobertura extensiva do genoma (incluindo genomas organelares), alto rendimento na genotipagem, praticidade na integração e na comparação dos dados obtidos (MCCOUCH et al., 1997; HOSBINO et al., 2002; FALEIRO, 2007; PARIDA et al., 2009; MIAH et al., 2013; SUN et al., 2014).

Microssatélites são extensivamente utilizados em mapeamento genético e populacionais, bem como no estudo de inúmeras questões biológicas, desde nível individual, de família, populacional até de espécie (BUSCHIAZZO e GEMMELL, 2006). A codominância e o elevado polimorfismo, por exemplo, fazem dos microssatélites ideais para estudos de sistemas de cruzamento em populações, auxiliando na determinação da origem do pólen e do quanto de fecundação cruzada ou autofecundação ocorrem intrapopulacionalmente, possibilitando ao pesquisador elaborar estratégias in situ e ex situ de conservação (HOSBINO et al., 2002).

A enorme diversidade alélica destes marcadores também proporciona caracterização acurada de indivíduos, bem como o monitoramento, ao longo das gerações, da transmissão de genes, acelerando o progresso na estimativa de parâmetros genéticos (CHASE et al.,1996).

Microssatélites também são utilizados para acessar a variação genética em coleções de germoplasma para escolha de genitores em cruzamentos, no mapeamento e marcação de genes, mapeamento de genoma, estudos de estrutura populacional e de relações filogenéticas (KALIA et al., 2011).

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