Kitâbü Tasdîkı’l-Maârif .1 Eserin ismi: .1 Eserin ismi:

A princípio as bactérias foram caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos. As bactérias: i) cujo índice de similaridade foi menor que 0,5; ii) que foram afiliadas apenas a níveis taxonômicos superiores como gênero ou família; iii) que não foram identificadas, tiveram seu DNA genômico extraído e foram submetidas ao sequenciamento do gene 16S rRNA.

5.2.1.4.1 Extração de ácidos graxos

As bactérias foram cultivadas em meio TSA (100%) pelo método de estrias cruzadas e incubadas a 28°C por 24 horas. Decorrido o tempo, as colônias do terceiro quadrante foram raspadas das placas e transferidas para tubos de vidro com tampa de rosca (Kimex). As amostras foram saponificadas com 1 mL do reagente de saponificação (45 g de NaOH, 150 mL de metanol e 150 mL de água deionizada) e homogenizadas vigorosamente com auxílio de agitador de tubos por 10 segundos. Os tubos foram colocados em água fervente (100°C) por 5 minutos, esfriados, homogenizados por 10 segundos e colocados novamente a 100°C por 25 minutos. Em seguida, foram adicionados 2 mL do reagente de metilação (325 mL de HCl 6N e 275 mL de metanol), seguido de incubação em banho-maria a 80°C por 10 minutos. Os ácidos graxos presentes na fase orgânica foram separados da fase aquosa por meio de adição de 1,25 mL do reagente de extração (200 mL de hexano e 200 mL de terc-butil metil éter). A fase aquosa foi descartada e 3 mL do reagente de lavagem (10,8 g NaOH e 900 mL água deionizada) foram adicionados para limpar a fase orgânica a ser analisada. A fase orgânica, contendo os ácidos graxos, foi transferida para tubos de vidro (“vials”) apropriados para análise cromatográfica (SASSER, 1990). A análise dos ácidos graxos foi realizada por meio de cromatógrafo gasoso (Agilent GC System Serie 6850).

5.2.1.4.1.1 Análise de ácidos graxos

Os ácidos graxos foram analisados por um programa de Identificação Microbiana (MIDI, Biblioteca Sherlock® TSBA versão 6.0, Microbial ID, Newark, DE, USA). Os perfis dos ácidos graxos obtidos foram comparados com os dados contidos na biblioteca TSBA 6 v.6.1 de junho de 2008. O índice de similaridade (IS) maior ou igual a 0,5 e separados no mínimo de 0,1 entre a primeira e a segunda identificação (KUNITSKY et al., 2006), foi

considerado para classificar os isolados a nível específico; índices mais baixos foram considerados apenas para filiação dos isolados a níveis taxonômicos como gênero ou família.

5.2.1.4.2 Extração de DNA genômico

Após a obtenção dos isolados, foi realizada a extração de DNA destes, de acordo com Sunnucks e Hales (1996) com algumas modificações. Os isolados foram crescidos em 5 mL de TSB (10%) a β8°C por β4 horas. Ao “pellet”, obtido por centrifugação a 14000 x g por 5 minutos, foram adicionados 400 μL de tampão TEN (10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 2 mM EDTA (pH 8,0); 0,4 M NaCl), 40 μL de dodecil sulfato de sódio (β0%) e 8 μL de proteinase K (Sigma) (20 mg.L-1). A suspensão foi incubada a 55°C por 1 hora, seguida de adição de 300 μL de NaCl (5,5 M) e homogenizada vigorosamente com auxílio de agitador de tubos por 30 segundos. A suspensão foi centrifugada a 14000 x g por 30 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. O DNA foi precipitado com 1 volume de isopropanol e mantido a -20°C por 2 horas. A suspensão foi então centrifugada a 14000 x g por 15 minutos a 4°C e o “pellet” foi lavado com 1 mL de álcool etílico (100%) e centrifugado a 14000 x g por 5 minutos, seguido de descarte do sobrenadante. O “pellet” de DNA foi lavado com álcool etílico (70%) e novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores. O excesso de álcool etílico foi evaporado a temperatura ambiente e foram adicionados β0 μL de água ultrapura (Milli-Q) autoclavada e mantido a -20°C. A integridade do DNA foi verificada em gel de agarose 1,0%. Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 mg.mL-1) e fotografado.

5.2.1.4.2.1 Amplificação do gene 16S rRNA

Com a obtenção de DNA de boa qualidade, foi realizada a amplificação do gene 16S rRNA, com o uso dos oligonucleotídeos iniciadores 1492R (5´- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT - 3´) e 27F (5´- GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG - 3´). As reações de PCR foram realizadas para um volume de β5 μL, contendo 17,γ5 μL de água ultrapura (Milli-Q) autoclavada, β,5 μL de Taq buffer (10X) (Fermentas), 0,9 μL de MgCl2 (25mM) (Fermentas),

β,0 μL de dNTP (β,5 mM), 0,1 μL de cada oligonucleotídeo iniciador, 0,β5 μL de Taq DNA polimerase (Fermentas), 0,8 μL de DMSO e 1 μL de DNA molde (10 a β0 ng). As reações de amplificação foram submetidas a um termociclador (Applied Biosystems), programado para realizar uma desnaturação inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos de 1 minuto a

94°C; 1 minuto a 60°C; 2 minutos a 72°C, e uma extensão final de 10 minutos a 72°C. Os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,0%, juntamente com o marcador de peso molecular 1kb DNA Ladder para a observação do fragmento de aproximadamente 1500 pb amplificado. Após a eletroforese, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (1,0 mg.mL-1) e fotografado.

5.2.1.4.2.2 Purificação do produto de PCR

As amostras de DNA amplificadas foram purificadas com 1,5 μL do mix de enzimas na proporção de β μL de Fast-Ap (Fermentas) para 0,8 μL de Exonuclease I (Fermentas). As amostras foram submetidas a um termociclador (Applied Biosystems) por 15 minutos a 37°C e 5 minutos a 80°C. As amostras purificadas foram quantificadas em gel de agarose 1,0% a 3 volts. cm-1.

5.2.1.4.2.3 Reação para sequenciamento

Os produtos de PCR purificados foram submetidos à reação para sequenciamento, onde para cada amostra foram utilizados três oligonucleotídeos iniciadores: 1492R (5´- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT - 3´), 27F (5´- GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG - 3´) e qPCR (5´- CCT ACG GGA GGC AGC AG - 3´) em reações independentes. Cada reação continha: 1 μL de Big Dye, γ,5 μL de tampão Save Money, 0,08 μL de oligonucleotídeo iniciador, 1 a γ μL de produto de PCR (50-100 ng) e água ultrapura (Milli-Q) autoclavada para um volume final de β0 μL. As reações foram submetidas a um termociclador (Applied Biosystems), programado para realizar uma desnaturação inicial de 1 minuto a 96°C, seguido de 35 ciclos de 15 segundos a 96°C; 15 segundos a 50°C; 4 minutos a 60°C.

5.2.1.4.2.4 Precipitação

As amostras foram precipitadas com adição de 2 μL de EDTA (1β5 mM), β μL de acetato de sódio (γ M) e 50 μL de álcool etílico (100%), seguida de mistura por inversão quatro vezes e incubação a temperatura ambiente por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 3000 x g por 30 minutos e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, em cada amostra foram adicionados 70 μL de álcool etílico (70%) e centrifugadas a 1650 x g por 15 minutos a 4°C. O excesso de álcool etílico foi evaporado a temperatura ambiente e as

amostras foram armazenadas a -20°C até preparo para injeção no ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

5.2.1.4.2.5 Análise das sequências e construção árvore filogenética dos isolados

A qualidade das sequências foi checada utilizando-se o programa FinchTV 1.4.0 (Geospiza Inc.) e as três sequências de cada oligonucleotídeo iniciador foram manualmente unidas utilizando o programa BioEdit 7.1.3.0 (HALL, 1999). As sequências foram comparadas com sequências depositadas no banco de dados do Ez Taxon (http://eztaxon- e.ezbiocloud.net/) para identificação de procariotos (KIM et al., 2012). As sequências foram alinhadas com ClustalW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994) e utilizadas para a construção das árvores filogenéticas pelo método de distância de Neighbor-Joining (SAITOU; NEI, 1987), utilizando-se o modelo de Jukes-Cantor (JUKES; CANTOR, 1969) com bootstrap de 1000 repetições (FELSENSTEIN, 1985), com o programa MEGA 5.01 (TAMURA et al., 2011). A similaridade entre as sequência foi obtida por meio do programa PHYDIT versão 3.1, um editor de sequência para filogenia (CHUN, 2001).