Kesilmiş uzunluk parçacıklarının (KPUP) gözlenmesi

3.3.2.1. COI geni için KPUP

COI geni için 55 farklı populasyonun herbirinden 2’şer koloni için 8 farklı restriksiyon endonükleaz enzimi (SspI, Sau3AI, FokI, BcI I, Nco I, StyI, BstUI, XhoI) ile kesim yapılmıştır. Eskişehir populasyonu hariç diğer tüm populasyonları temsil eden örnekler her bir enzim için A tipinde kesim bir profili oluşturmuştur. Eskişehir populasyonunda ise SspI enzimi için A ve B tipinde iki farklı kesim örüntüsü oluşurken diğer enzim kesimleri bakımından incelenen tüm populasyonlarda A tipinde kesim profili oluşmuştur. (Çizelge 3.19 ve Resim 3.2).

Burada tüm enzimler ile kesim sonucu populasyonlarda genel olarak görülen kesim örüntüsü A tipi olarak yorumlanırken, A tipinden farklı olarak meydana gelen ikinci bir kesim örüntüsü B tipi olarak yorumlanmıştır.

Çizelge 3.19. COI gen bölgesine uygulanan enzimler, oluşan kesim örüntüsü ve parça

uzunlukları

SspI Sau3AI FokI BcII NcoI StyI BstuI XhoI

bç A B bç A bç A bç A bç A bç A bç A bç A 580 ― 371 ― 476 ― 465 ― 1028 ― 1028 ― 1028 ― 616 ― 487 ― 349 ― 425 ― 326 ― 412 ― 439 ― 280 ― 127 ― 237 ― 277 ― 28 ― 264 ―

a) COI/SspI b) COI/Sau3aI

c) COI/FokI d) COI/BcII

e) COI/NcoI, StyI, BstuI f) COI/XhoI

Resim 3.2. COI geni için KPUP sonuçları

Burada tezin kapsamını çok fazla genişleteceğinden dolayı 110 örneğe ilişkin KPUP sonuçlarını gösteren jel görüntülerinin tümüne yer verilmemiştir. Yalnızca her bir enzimi temsil eden birer jel görüntüsüne yer verilmiştir.

Resim 3.2a’da SspI enziminin COI genin PZR ürünlerine uygulanması sonucu meydana gelen kesim örüntüsü görülmektedir. Bu jel görüntüsündeki 6. örnek Eskişehir populasyonunu temsil etmektedir. Eskişehir’den alınan örnekler bu enzim ile 580 ve 439 bç uzunluğunda iki bant oluşturmuştur. Diğer tüm örnekler ise 487, 277 ve 264 bç uzunluğunda 3 bant oluşturmuştur.

Resim 3.2b, Sau3A I enziminin yine COI genine uygulanması sonucu meydana gelen kesim örüntüsünü göstermektedir. Bu enzimle kesim sonucunda 371, 349, 280 ve 28 bç uzunluğunda 4 bant oluştu. 371 ve 349 bç uzunluğundaki iki bant hemen hemen aynı uzunlukta olduğundan birbirine çok yakındır ve bu nedenle tek bir bant gibi görüntü vermiştir. Diğer taraftan 28 bç uzunluğundaki bant çok küçük olduğundan çoğu zaman jelde çok net bir görüntü oluşturmamıştır. Ancak bazı jel görüntülerinde ve kesim sonucu oluşan DNA bantlarının uzunlukları DNAfrag-0.3 paket programında hesaplanırken tespit edilmiştir.

Resim 3.3c’de FokI ile yapılan kesim sonuçları görülmektedir. Bu enzimle yapılan kesim çalışmasında başlangıçta sürekli sorun yaşanmıştır. Fakat daha sonra kesim reaksiyonu için hazırlanan reaksiyon karışımından 8.5 µl ve PZR ürününden 1.5 µl kullanılarak yapılan kesim reaksiyonu çok iyi sonuçlar vermiştir. Büyük bir olasılıkla enzim miktarının az geldiği düşünülerek yapılan modifikasyon başarılı olmuştur. FokI ile kesim sonucunda meydana gelen 476 ve 425 bç uzunluğundaki bantlarda uzunluk olarak benzer olduğundan jel üzerindeki yürüme hızları hemen hemen aynıdır bu nedenle birbirine çok yakındır ve tek bir bant gibi görüntü vermiştir.

COI geni üzerinde iki tanıma bölgesi bulunan BclI enzimi ile kesim sonucu 465, 326, 237 bç uzunluğunda üç bant meydana gelmiştir (Resim 3.2d).

NcoI, StyI ve BstuI enzimleri ile COI genin kesimi sonucu incelenen tüm populasyonların 1028 bç uzunluğunda tek bir bant oluştuğu görülmüştür (Resim 3.2e). COI genin PZR ürünü 1028 bç uzunluğunda olduğuna göre Türk bal arısı populasyonlarının mtDNA genomunun COI geninde bu enzimlerin tanıma bölgelerinin olmadığı tespit edilmiştir. Jel görüntüleri her üç enzim için tüm örneklerde aynı olduğundan hepsini temsilen burada yalnızca birine yer verilmiştir.

XhoI enzimi ile kesim sonucu incelenen tüm örneklerde 616 ve 412 bç uzunluğunda iki bant oluşmuştur (Resim 3.2f).

3.3.2.2. 16srDNA geni için KPUP

mtDNA’nın COI geni için incelenen tüm örnekler aynı zamanda ls rDNA geni bakımından da araştırılmıştır. Bu gen bölgesi için 7 restriksiyon endonükleaz enzimi (Sau3AI,

SspI, HıncII, AluI, DraI, EcoRI, PstI) ile kesim yapılmıştır. 16srDNA genin söz konusu 7 enzimle kesimi sonucunda incelenen populasyonlar arasında bir varyasyon olmadığı gözlenmiştir. Tüm populasyonlar mtDNA’nın 16srDNA geni üzerinde kesim bölgeleri araştırılan bu enzimler bakımından A tipinde tek bir kesim örüntüsü oluşturmuştur (çizelge 3.20) (Resim 3.3).

Çizelge 3.20. 16srDNA gen bölgesine uygulanan enzimler, oluşan kesim örüntüsü ve parça

uzunlukları.

Sau3AI SspI HıncII AluI DraI EcoRI PstI

bç A bç A bç A bç A bç A bç A bç A

548 ― 628 ― 598 ― 572 ― 964 ― 492 ― 621 ―

416 ― 336 ― 366 ― 392 ― 472 ― 343 ―

c) 16srDNA/Hinc II d) 16srDNA/Alu I

e) 16srDNA/Dra I f) 16srDNA/EcoRI

g) 16srDNA/PstI

Resim 3.3a’da SaU3A ile ls rDNA genin kesimi sonucunda tüm örnekler 548 ve 416 bp uzunluğunda iki bant oluşturmuştur. Tüm örneklerde aynı tip kesim örüntüsü gözlenmiştir. Resim 3.3’te a, b, c, d resimlerinde en üstte yaklaşık 968 bç uzunluğunda üçüncü bir bant görülmektedir. Bu bant kesilmeden kalan PZR ürünüdür.

İncelenen tüm örneklerde SspI ile kesim sonucunda 628 ve 316 bç uzunluğunda iki bant (resim 3.3b); HıncII ile kesim sonucunda 598 ve 366 bç uzunluğunda iki bant (Resim 3.3c); AluI ile kesim sonucunda 572 ve 392 bç uzunluğunda iki bant (resim 3.3d); EcoRI ile kesim sonucunda 492 ve 472 bç uzunluğunda iki bant (Resim 3.3f); PstI ile kesim sonucunda 621 ve 343 bç uzunluğunda iki bant (Resim 3.3g) meydana gelmiştir.

16srDNA genin üzerinde kesim bölgeleri araştırılan enzimlerden yalnızca DraI enziminin kesim bölgesine rastlanmamıştır. Dra-I kesimi sonucunda yaklaşık 968 bç uzunluğunda tek bir bant meydana gelmiştir. 16s rDNA genin PZR ürünü 968 bç uzunluğundadır; yani incelenen örneklerde 16srDNA genin DraI restrksiyon endonükleaz enzimi ile kesimi olmamıştır (Resim 3.3e.). Diğer taraftan A. m. macedonica, A. m. ligustica,

A. m. cyprus, A. m. cecropia’da ise bu kesim bölgesine rastlanmaktadır.

Resim 3.3e’de 4. ve 5. örneklerin zayıf bant vermesi PZR ürünün az olmasından ya da pipet hatasından kaynaklanmış olabilir. Aynı durum Resim 3.3f ve Resim 3.3g’de zayıf bant veren örnekler içinde söz konusudur. Fakat bantlar zayıfta olsa agoroz jel elektroforezinde gözlenebilmiştir. Bu nedenle bu örneklere ilişkin analizlerin yeniden yapılmasına gerek duyulmamıştır. Ancak örneklerden birine ait bantlar hiçbir şekilde gözlenemediğinde ya da şüpheli olduğu düşünüldüğünde kesim reaksiyonları yeniden yapılmıştır Çalışmada şüphe duyulan her örnek en az iki en çok üç kez yeniden KPUP yöntemi ile denenmiş, gerekirse PZR ürünü agaroz jel elektroforezi ile test edilmiştir.