Kemik yapım belirteçleri

Osteoblastlar, kemik formasyonunun belirteci olarak serumda ölçülebilen birçok proteini sentezlemekte ve salgılamaktadırlar. Kemik formasyonunun en sık kullanılan belirteçleri alkalen fosfataz, osteokalsin ve tip-1 prokollajenin karboksiterminal propeptididir (28). Osteoklast farklılaşmasını aktifleyen “Nükleer Faktör Kappa B Reseptör Aktivatör Ligandı (RANKL) ” ve RANKL inhibitörü olan “Osteoprotegerin”

gibi sitokinler de osteoblastlarda sentezlenmektedir (1,53).

2.3.3.1.1. Kemik alkalen fosfataz

Alkalen fosfatazlar; kemik, karaciğer, barsak, böbrek ve plasentayı içeren birçok dokuda bulunmaktadır. Karaciğer, böbrek ve kemik izoformları aynı genin ürünleri olup, doku spesifik izoformlar gen ürünündeki post translasyonel değişiklikler ile (glikolizasyon gibi) oluşmaktadır, Total alkalen fosfataz enzimin kökeni hakkında bilgi sağlamamakta ve sağlıklı kişilerde birincil derecede karaciğer ve kemikten kaynaklanmaktadır. Kemik izoenzimi ise kemik yapımının bir göstergesi olarak kullanılmaktadır (1).

Kemik alkalen fosfatazı osteoporoz, osteomalazi, raşitizm, hiperparatiroidi, gibi metabolik kemik hastalıkları, tirotoksikoz ve kemik yapımının arttığı birçok hastalıkta artmaktadır. Yarılanma ömrünün göreceli olarak daha uzun olması nedeni ile (1-3 gün) ölçümü osteokalsin ölçümünden daha avantajlıdır. Kemik ALP ölçümleri, kemik mineralizasyon oranları ile koreledir (1, 28, 52, 54).

Diurnal değişikliklerden az etkilenmektedir. Özel bir örnek alma işlemi gerektirmemektedir. Glomeruler filtrasyona uğramadığı için böbrek işlevleri bozuk olan kişiler için daha uygundur. Karaciğer hastalığı olan kişilerde kemik alkalen fosfataz ölçümü, mevcut yöntemlerde karaciğer enzimi ile olabilecek çapraz tepkime nedeni ile yanıltıcı olabilmektedir. 1,25-dihidroksi D vitamininin kemik alkalen fosfataz ve osteokalsin sentezini düzenliyor olması nedeni ile, bu hormonun kullanıldığı hastalarda elde edilen veriler yanıltıcı olabilmektedir.

Kemik izoformunu ölçmek üzere ısı ile inaktivasyon, kimyasal inhibisyon, elektroforez, izoelektrik odaklama, HPLC gibi birçok yöntem bulunmaktadır. Ölçüm için çeşitli immunassay teknikleri de geliştirilmiştir. Bu tekniklerin analitik ve klinik performansına ilişkin birçok çalışma yayınlanmıştır. Ancak hiç biri kemiğe tam spesifik olmayıp %7-17 oranında karaciğer enzimi ile çapraz tepkime oluşturmaktadır.

Referans değerleri cinsiyet ve yaşa bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Erkeklerde ve ileri yaşlarda daha yüksek düzeylerde bulunmaktadır.

2.3.3.1.2.. Osteokalsin

Osteokalsin (OC, veya kemik gla proteini, BGP), 49 aminoasitten oluşan, k üçük, kollajen dışı bir proteindir. Kemikte, kollajen dışı proteinin en büyük oranını oluşturmaktadır. K vitaminine bağlı posttranslasyonel karboksilasyon ile γ-karboksiglutamata (gla) dönüşebilen, 3 spesifik glutamik asid rezidüsü içermektedir (55,56). Serumda karboksilasyon düzeyi az olan osteokalsinin varlığında, kemik dansitesinin de düşük olduğu bildirilmiştir. Üretilen osteokalsinin büyük bir bölümü ise hidroksiapatite bağlanarak kemik matriksine dahil olmaktadır. Fizyolojik rolü henüz bilinmemektedir. Ancak hidroksiapatit kristallerinin birikimi için bir depo olarak işlev görüyor olabilir (12).

Kemik yapımı sırasında osteoblastalardan sentezlenen osteokalsinin %10 -30’unun dolaşıma salınması nedeni ile bir yapım belirteci olarak kabul edilmektedir. Kemik rezorbsiyonu sırasında da osteokalsin, özellikle fragmanları serbestleşebilmektedir.

Böbrekler ile atılıma uğrayan osteokalsinin dolaşımdaki yarılanma ömrü 5 dk kadardır.

İmmünokimyasal ve kromatografik çalışmalar, normal kişiler ile paget hastalığı olan, osteoporotik kişilerin dolaşımında bulunan osteokalsinin belirgin bir heterojenite gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu durum muhtemelen duyarlı peptid bağlarının hidrolizinden kaynaklanmaktadır.

Serum osteokalsin düzeylerini ölçecek çeşitli immunasssay yöntemleri bulunmasına rağmen, farklı epitopları tanıyan değişik antikorların kullanılması, molekülün stabil olmaması ve uluslararası kabul görmüş bir standardın bulunmaması nedeni ile yöntemler arasında bir karşılaştırma yapmak güçtür. Serumda tüm molekülün yanısıra çeşitli fragmanlar da bulunmaktadır (55) (Şekil 7). Bu fragmanlar kemik oluşumu ya da yıkımı sırasında oluşabildikleri gibi, dolaşımda veya preanalitik işlemler sırasında da oluşabilmektedirler. Osteokalsin metabolizmasının daha iyi anlaşılması ve yeni yöntemlerin geliştirilmesi ölçümlerde standardizasyonu sağlayabilecektir.

En yaygın kullanılan örnek serum olup, örneğin stabilitesi kullanılan yönteme bağlı olarak değişebilmektedir. İntakt osteokalsin ve N-terminal, orta bölgeyi ölçen yöntemlerde örnek stabilitesi daha fazladır. Kan örnekleri buz üzerine alınmalı, 1 saat içinde santifüj edilmeli ve hızla dondurulmalıdır.

Osteokalsinin kan düzeyleri geceleri en üst düzeye ulaşacak şekilde diurnal değişiklik göstermekte, ayrıca cinsiyet ve yaşa göre farklılıklar gözlenmektedir. Menapozda sıklıkla yüksek değerler saptanmaktadır. Böbrek yetmezliği de kan değerlerinde artışa yol açmaktadır.

OC ve ALP’ın osteoblastların ürünü olmasına rağmen konsantrasyonlarındaki değişikliklerin paralellik göstermemesi, farklı süreçleri yansıttıklarını düşündürmektedir.

Şekil 7: Dolaşımdaki osteokalsinin heterojenitesi (52).

2.3.3.1.3. Prokollajen I uzantı peptidleri

Kemik organik matriksinin %90’ını oluşturan tip I kollajen, prokollajen prekürsör molekülü olarak sentez edilmektedir. Prokollajen molekülü, kollajen kemik matriksine katılmadan önce spesifik endoproteazlar ile ayrılan -amino ve -karboksi terminal uzantı peptidleri içermektedir. Bu uzantılar veya propetidler kemik formasyonunu

belirteçleri olarak ölçülebilmektedir. N-terminal (PINP) ve C-terminal (PICP) propeptidleri ölçmek üzere çeşitli immunassay yöntemleri geliştirilmiştir.

Zincir arası disülfid bağları ile stabile olan ve 100,000 kDa’lık moleküler ağırlığa sahip olan tip I prokollajenin (PICP) trimerik karboksi-terminal propeptidi glomerüllerden filtre edilmemekte ve bu nedenle böbrek işlevlerinden etkilenmemektedir. PICP’nin yarılanma ömrü 6-8 dakika arasındadır ve hepatik endotelyal hücrelerin mannoz-reseptör yolağı ile spesifik bir reseptör aracılığıyla temizlendiği düşünülmektedir. Kemik matriksinde depolanan kollajenin kan akımına salınan PICP’e oranı 1:1 olmalıdır.

PICP serumda stabil olup birçok kez dondurulmuş ve çözdürülmüş olan örneklerde güvenilir olarak ölçülebilir. Molekülün 15 gün boyunca oda ısısında stabil olduğu gösterilmiştir. Serum PICP konsantrasyonları kemik histomorfometri ve tüm vücut kalsiyum kalsiyum kinetiği göstergeleri ile de koreledir. Ancak menapozda görüldüğü gibi, kemik döngüsündeki ufak değişiklikleri saptayacak kadar sensitif değildir . Diğer uzantı peptidi olan tip I prokollajenin amino-terminal propeptidi (PINP) için de immunoassay yöntemi tarif edilmiştir. PINP serumda 100- ve 30-kDa’lık iki temel parça olarak bulunmaktadır. Daha küçük olan molekül olasılıkla bir yıkım ürünüdür.

Mevcut yöntemler intakt molekülü ve fragmanı tanımaktadır ve o kadar sensitif değildir. Sadece intakt molekülü tanıyan yeni bir immunoassay yönteminin kemik formasyonundaki değişiklileri saptamada yeterli olduğu gösterilmiştir (28,52,56).

Kollajenin kemik dışı birçok dokuda da temel matriks olması nedeni ile bu propeptidler kemik formasyonunun göstergeleri olaral kemik ALP ve osteokalsin kadar sensitif ve spesifik değildirler ( Tablo 7).

Tablo 7: Kemik Yapım Belirteçlerinin Karşılaştırılması (28)

İdeal Kemik ALP OC Prokollajen Peptidler

Spesifite Kemik Kemik Kemik Tip 1 Kollajen

Sedece kemik yapımı ile artış Evet Hayır Hayır Hayır

Renal atılım Hayır Hayır Evet Hayır

Sirkadiyen değişiklik Hayır Hayır Evet Evet Karaciğerde metabolize olma Hayır Hayır Hayır Evet Normal ve hızlı kemik yapımı

Kemik sialoproteini (BSP) 80 kDa’lık glikozile fosfoproteindir. Osteoblastlar tarafından sentez edilmekte ve kemik mineralizasyonunda rol aldığı düşünülmektedir.

Metabolik kemik hastalarında serum konsantrasyonunun artmaktadır. Nedeni belli olmamakla birlikte, serum BSP düzeyleri formasyondan ziyade kemik rezorpsiyonu ile daha iyi korelasyon göstermektedir (52).