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Le chargement des miRNAs dans RISC est intimement lié à la maturation des pré- miRNAs par Dicer. Chez l’homme, le RLC (RISC Loading Complex), composé au minimum des protéines Dicer, TRBP et Ago2 dans un complexe ternaire équimoléculaire 1:1:1, permet de réaliser ce couplage (Chendrimada et al., 2005; Gregory et al., 2005; MacRae et al., 2008) (figure 7). In vitro, le RLC reconstitué par les trois protéines recombinantes est capable

Figure 7 Dicer TRBP Ago2 Dicer TRBP Ago2 Dicer TRBP Ago2 Dicer TRBP

A

B

déroulement du double brin et formation de RISC hélicases 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ Ago2 RISC dégradation clivage par Ago2 Dicer TRBP Ago2 ? clivage par Dicer 5’ 3’ 5’ 3’ pré-miRNA RLC double brin de miRNA Ac-pré-miRNA double brin de miRNA

Figure 7 : Etapes de la formation du complexe RISC chez l’homme.

(A) Formation du complexe RLC (RISC Loading Complex). L’hétérodimère formé par Dicer et TRBP recrute Ago2 pour former le complexe RLC. Ce complexe interagit alors avec les pré-miRNAs exportés. (B) Maturation des pré-miRNAs et sélection d’un des brins du double brin en tant que miRNA. Dicer, au sein du RLC, clive le pré-miRNA pour libérer un double brin d’ARN. Sur certains pré-miRNAs (ac-pré-miRNAs, ago2-clived pre- miRNAs), Ago2 clive le brin 3’ de la tige avant même l’excision de la boucle par Dicer. Ce clivage se fait en général sur des tiges possédant un appariement élevé. Il est suggéré qu’Ago2 puisse réaliser ce clivage au sein du RLC. Suite au déroulement du double brin de miRNA par des hélicases, un des deux brins (ici en rouge) est sélectionné et interagit alors avec Ago2 (violet) pour former le cœur minimum de RISC. Le brin passager (ici en noir) est dégradé. Pour les ac-pré-miRNAs, la sélection du brin 5’ est privilégiée du fait du clivage du brin passager. RISC : RNA-induced Silencing complex. Adapté de (Diederichs and Haber, 2007) avec permission.

d’effectuer toutes les étapes caractéristiques de maturation des pré-miRNAs et de chargement des miRNAs dans RISC : (i) la reconnaissance des pré-miRNAs et le clivage par Dicer, (ii) la sélection d’un des deux brins (car un seul petit ARN simple brin peut être lié à Ago2 (Martinez et al., 2002)) et la suppression du brin non incorporé, (iii) l’interaction du miRNA avec Ago2 (MacRae et al., 2008; Martinez et al., 2002; Rivas et al., 2005). Néanmoins, d’autres protéines telles que PACT, Gemin 3, p68, RHA ou encore MOV10 ont été impliquées dans la formation et/ou les fonctions de RISC in vivo (Lee et al., 2006; Meister et al., 2005; Mourelatos et al., 2002; Robb and Rana, 2007; Salzman et al., 2007).

Pour la majorité des duplexes d’ARN, l’incorporation dans RISC est asymétrique et l’un des deux brins est privilégié (Hutvagner, 2005; Khvorova et al., 2003; Kim, 2005; Schwarz et al., 2003). Cette asymétrie est liée au fait que le brin dont l’extrémité 5’ dans le double brin d’ARN possédant une interaction ARN-ARN moins stable énergétiquement (sur environ 4 paires de bases) est chargé dans RISC en tant que miRNA (figure 8). Cependant, cette règle ne semble pas absolue car l’autre brin, dit minoritaire (miR-X*), peut être détecté dans des complexes RISC (Okamura et al., 2008).

Figure 8 interaction énergétiquement moins stable 5’ 5’ miR-X majoritaire

Figure 8 : Asymétrie dans la sélection d’un des deux brins d’un double brin de miRNA en tant que miRNA mature

Le rectangle bleu en pointillé indique une stabilité d’interaction à l’extrémité du double brin du miRNA moins élevée que le rectangle bleu à trait plein. Le brin en rouge (ou miR-X, X étant un chiffre) sera majoritairement choisi pour être incorporé dans RISC. Le brin en noir (miR-X*, X étant un chiffre, * pour indiquer le brin minoritaire) représente le miRNA qui sera minoritairement incorporé dans RISC.

Le RLC minimum est capable d’incorporer de manière asymétrique let-7a et non let- 7a* issu du pré-let-7a in vitro, suggérant que ce complexe puisse effectuer le choix du

miR-X* minoritaire 5’

5’ interaction énergétiquement

miRNA à incorporer dans RISC (MacRae et al., 2008). Cependant, le chargement asymétrique par le RLC reste encore mal compris. Il se peut que TRBP agisse en coopération avec Dicer pour « jauger » le profil thermodynamique des extrémités des ARNs double brin comme le font R2D2/Dicer-2 impliqués tous les deux dans la maturation des siRNAs chez la drosophile. En effet, R2D2, une RBP cofacteur de Dicer-2, lie l’extrémité 3’ qui montre la plus forte interaction ARN-ARN alors que Dicer-2 interagit avec l’extrémité opposée du duplexe (Tomari et al., 2004).

Cette sélection s’accompagne d’une suppression du brin non incorporé dans RISC. Le mécanisme communément admis serait qu’une ou plusieurs hélicases telles que Gemin 3 (Mourelatos et al., 2002), p68 (Salzman et al., 2007), RHA (Robb and Rana, 2007) ou MOV10 (Meister et al., 2005) impliquées dans la formation et/ou les fonctions de RISC aideraient au déroulement du double brin d’ARN. L’ARN non incorporé est alors dégradé (figure 7B). Il est à noter que l’activité hélicase des protéines requière de l’ATP mais certaines publications semblent soutenir que celui-ci ne soit pas fondamental à la formation de RISC (Gregory et al., 2005; MacRae et al., 2008; Maniataki and Mourelatos, 2005), suggérant que ces hélicases contribuent mais ne seraient pas systématiquement requises lors de la formation de RISC. Il est possible que l’énergie libérée par le clivage des pré-miRNAs par Dicer soit suffisante aux étapes de déroulement par les hélicases du fait du couplage maturation/chargement des miRNAs dans RISC. Bien que l’hypothèse ne soit pas vérifiée, le domaine hélicase de Dicer (figure 6) pourrait participer au déroulement de l’hélice, ce qui serait en accord avec le fait que le RLC minimum (Dicer, TRBP, Ago2) in vitro puisse sélectionner et faire interagir un miRNA avec Ago2 (MacRae et al., 2008). Bien qu’aucune étude n’ait été encore réalisée dans ce sens, nous ne pouvons exclure une dégradation potentielle des brins non incorporés à RISC dans le double brin d’ARN lui même par une RNAse au lieu d’un déroulement de l’hélice, éventuellement en accord avec la non nécessité de l’ATP (figure 7B) (Caudy et al., 2003). Quoiqu’il en soit, le (ou les) facteur(s) impliqué(s) dans ces mécanismes de suppression d’un des deux brins d’un duplexe d’ARN n’a pas encore été formellement découvert (Hutvagner and Simard, 2008).

Enfin, pour certains pré-miRNAs, Ago2 probablement au sein du RLC clive le brin 3’ des tiges ayant une complémentarité de séquence élevée, et, ceci avant même la maturation par Dicer (Diederichs and Haber, 2007) (figure 7B). Ceci a pour effet d’orienter le chargement du brin 5’ de ces ac-pré-miRNAs (Ago2-cleaved precursor miRNA) dans RISC. Ce phénomène de clivage d’un des deux brins est par ailleurs courant pour des siRNAs double brin

(parfaitement appariés) et permet d’orienter le petit d’ARN à charger dans RISC (Hutvagner and Simard, 2008; Leuschner et al., 2006; Matranga et al., 2005).

Les protéines Ago en interagissant avec les miRNAs constituent le cœur minimum actif de RISC (Hutvagner and Simard, 2008; Martinez et al., 2002; Rivas et al., 2005). Les domaines PAZ, PIWI et Mid sont essentiels à l’interaction avec les miRNAs/siRNAs (Hutvagner and Simard, 2008; Parker et al., 2005; Yan et al., 2003). Si chez la drosophile Ago1 est spécialisé dans la voie des miRNAs et Ago2 dans la voie des siRNAs, chez l’homme il semble que cette spécialisation des protéines Ago (au nombre de quatre) n’existe pas (Okamura et al., 2004). De plus, les différentes protéines Ago humaines interagissent avec les miRNAs ou siRNAs sans réelle sélectivité, suggérant que le chargement des petits ARN dans RISC par le RLC ne privilégie aucune des protéines Ago (Azuma-Mukai et al., 2008; Liu et al., 2004).

Plusieurs protéines sont capables d’interagir de façon directe ou indirecte avec les protéines Ago. Parmi celles-ci, il est retrouvé des hélicases, des RBP, des nucléases, des chaperonnes (Caudy et al., 2003; Chendrimada et al., 2005; Chu and Rana, 2006; Doi et al., 2003; Haase et al., 2005; Hock et al., 2007; Lee et al., 2006; Liu et al., 2005; Meister et al., 2005; Mourelatos et al., 2002; Robb and Rana, 2007; Sasaki et al., 2003; Tahbaz et al., 2001; Tahbaz et al., 2004). Certaines d’entre elles sont essentielles au bon fonctionnement de RISC comme par exemple PACT (Lee et al., 2006), TRBP (Chendrimada et al., 2005; Haase et al., 2005), RHA (Robb and Rana, 2007), GW182 (Liu et al., 2005), RCK/p54 (Chu and Rana, 2006) ou Dicer (Meister et al., 2005; Tahbaz et al., 2004). Toutefois, puisque la protéine Ago intervient dès l’étape de maturation des pré-miRNAs ainsi que dans les étapes ultérieures d’inhibition d’expression (figure 7), il est difficile de définir si ses partenaires sont réellement associées au RISC actif. Par exemple, une diminution d’expression de Dicer, TRBP, PACT ou RHA entraîne un défaut dans la répression de l’expression de gènes rapporteurs par des siRNAs (Chendrimada et al., 2005; Doi et al., 2003; Haase et al., 2005; Lee et al., 2006; Robb and Rana, 2007). Ce défaut observé lors de la sous-expression de ces protéines est potentiellement imputable au fait que celles-ci soient au cœur de RISC actif ou parce qu’elles participent à la biogenèse de celui-ci au travers du RLC. Les différentes façons de purifier les complexes RISC dans les diverses publications font ressortir des protéines qui sont peut être associées de manière transitoire et reflète vraisemblablement un complexe dynamique difficile à caractériser.

III- Les mécanismes de régulation de l’expression post-transcriptionnelle des gènes par