A ausência de diferença significativa entre os resultados das provas, segundo o teste estatístico utilizado, indica substancial concordância entre os
resultados (χ2=3,03; p=0,0820), com índice κ=0,6686 ± 0,0477 (IC95% =
0,5752 – 0,7620).
A sensibilidade é definida como a habilidade do teste identificar corretamente os rebanhos infectados e a especificidade, definida como a habilidade do teste em identificar corretamente os não-infectados (MARTIN et al., 1994). No presente estudo, considerando-se a prova microbiológica como padrão-ouro, a sensibilidade foi de 0,8571 ± 0,0353 (intervalo de confiança 95% de 0,7719 – 0,9196) e a especificidade 0,8255 ± 0,0311 (intervalo de confiança 95% de 0,7549 – 0,8827).
A sensibilidade e a especificidade são atributos intrínsecos do teste. No entanto, os indicadores de desempenho, quando aplicados em condições de campo são modificados pela proporção de casos da doença no rebanho, ou seja, pela prevalência. Assim, para estimar a validade do instrumento em condições operacionais devem-se calcular os indicadores denominados valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, cujos valores variam com a prevalência. Entende-se por valor preditivo positivo a probabilidade de um caso identificado com determinada ferramenta ou método, ser de fato positivo. Valor preditivo negativo a probabilidade de um resultado negativo obtido, ser de fato negativo. Os resultados dessas variáveis, que são influenciados pela sensibilidade e especificidade do teste, estão, dessa forma, ligados à prevalência de S.agalactiae encontrada neste estudo, de 39,67% (LAST, 1998;
MACKINNON, 2000)
Assim como ocorre com as taxas de valores preditivos, os valores referentes aos falsos positivos e negativos também são afetadas pela prevalência.
As amostras negativas à PCR, além do que já foi discutido anteriormente, poderiam ser testadas para um marcador interno, utilizando-se um primer bovino para a certificação da amplificação dos produtos na amostra,
pois os resultados negativos tanto aos oligonucleotídeos V1 e V2 como ao C1 e C2 são um forte indicativo da não amplificação de qualquer produto. É sabido que no leite de vacas, principalmente naqueles que resultam de amostragem de todo o rebanho e com contagens bacterianas altas, microrganismos do gênero estreptococo são comumente encontrados e consequentemente esses microrganismos seriam detectados pelos oligonucleotídeos genéricos.
Os resultados da frequência de ocorrência do S.agalactiae relatada
pelo presente estudo, quer pelo cultivo microbiológico, quer pela técnica de PCR permite reafirmar a importância do agente nas mastites bovinas. Esses resultados auxiliam no delineamento de medidas profiláticas no manejo das propriedades e na conscientização de profissionais, técnicos e produtores da
importância do controle e erradicação do S.agalactaie. Tais medidas
contribuiriam na redução do impacto da enfermidade no rebanho mas, de forma abrangente, na qualidade do leite produzido no pais.
7 - C
ONCLUSÕESA prevalência de S.agalactiae nos rebanhos estudados foi de 39,67%.
A média da contagem bacteriana total no leite do tanque dos rebanhos
estudados foi de 1,08x106 UFC/mL e a mediana de 160,00 x103 UFC/mL de
leite
A PCR de amostras do leite do tanque de expansão do rebanho pode ser utilizada como um método auxiliar para o diagnóstico de mastite contagiosa
por S.agalactiae e poderá tornar-se uma ferramenta útil para monitorar a
7 – R
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A
NEXO1
Protocolo de extração de DNA de amostras de leite (modificado de GUIDO, 2003)
9 homogeneizar por 30 segundos em agitador orbital (Vórtex); 9 aliquotar 500µL e transferi-los a microtubo plástico de 1500 µL; 9 centrifugar a 24°C por dez minutos a 14000xg;
9 descartar o sobrenadante por inversão;
9 adicionar 500µL de TE (10mM de TrisHCL, pH 8,0 e 1mM de EDTA, pH 8,0);
9 centrifugar a 24°C por dez minutos a 14000xg;
9 repetir os passos dos itens 4, 5 e 6 até obtenção de sobrenadante translúcido;
9 amostras onde é possível observar, após cinco lavagens com TE, a presença de gordura no sobrenadante, iniciar o protocolo a partir do item 1 e adicionar na primeira alíquota de 500µL de amostra pura, 50µL de Tween 20% (adaptado de SERPE et al, 1999);
9 adicionar solução de lise composta de: - 4 µL de TrisHCl, pH 8,0 a 1M;
- 20 µL de EDTA 0,5M; - 8µL de NaCl 5M; - 40µL SDS 10%,
- 10 µL de proteinase K a 20mg/mL (Invitrogen®) - 418 µL de água ultra pura;
9 homogeneizar por dez segundos em agitador orbital (Vórtex);
9 incubar a 56°C por duas horas ou por 18 horas a 37°C em
termobloco (Thermomixer Comfort 5355 Eppendorf®) sob agitação a 1400rpm
9 colocar em banho de gelo por 15 minutos; 9 adicionar 500µL de fenol tamponado (UBS);
9 homogeneizar por dez segundos em agitador orbital (Vórtex); 9 centrifugar a 24°C por cinco minutos a 14000xg;
9 transferir 400µL da fase aquosa para novo microtubo de 1500 µL; 9 adicionar 200µL de fenol tamponado e 200µL de clorofórmio; 9 homogeneizar por dez segundos em agitador orbital (Vórtex); 9 centrifugar a 24°C por cinco minutos a 14000xg;
9 transferir 300µL da fase aquosa para novo microtubo de 1500 µL; 9 adicionar 300µL de propanol;
9 homogeneizar por dez segundos em agitador orbital (Vórtex);