ICA 56
Realizaram-se dois ensaios distintos para avaliar a biodegradabilidade do biossurfactante produzido: (a) primeiramente avaliou-se a capacidade de degradação do biossurfactante por parte do micro-organismo Pseudomonas putida CECT 324, adquiridas da Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (Valência, Espanha). As bactérias foram adquiridas na forma liofilizada. Este teste tem duração de 72 horas; (b) Posteriormente, realizou-se o ensaio denominado método estático, com duração de 28 dias, seguindo a Norma UNE 55-844-91, aplicada para avaliação da biodegradabilidade de tensoativos aniônicos e não iônicos comerciais empregados na formulação de detergentes.
Capítulo 4 - Materiais e Métodos SOARES, D.W.F.
4.13.1. Ensaios de biodegradabilidade utilizando Pseudomonas putida
O primeiro foi realizado utilizando o micro-organismo Pseudomonas putida, um gênero de bactéria. A bactéria Pseudomonas putida CECT324, gram-negativa em forma de bastonete foi adquirida da Coleção Espanhola de Cultivos Tipo (Valência, Espanha). Esta cultura foi reativada em placas de Petri composto por 1,0 g/L de extrato de carne, 2,0 g/L de extrato de levedura, 5,0 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl e 15 g/L de ágar com pH 7.2. No cultivo estão presentes duas fontes de carbono, a proveniente do biotensoativo ensaiado e a fonte de carbono biodegradável do meio criogênico que está presente no estoque bacteriano.
A metodologia adotada nos testes de biodegradabilidade com Pseudomonas putida encontra-se descritas no trabalho de Lechuga e colaboradores (2012), seguindo a Norma UNE-EN ISO 10712:1996. Basicamente, o teste consiste nos seguintes passos: (a) repicar placas (inoculação) com o micro-organismo; (b) incubar as placas a 30 ºC por 24 horas; (c) transferir as colônias para um meio nutritivo que será descrito a seguir; (d) incubar a 30 ºC o erlenmeyer de capacidade de 50 mL contendo 20,0 mL contendo meio de cultivo e as colônias que foram transferidas, por 24 horas; (e) após trancorridas 24 horas, inocular (utilizando 200 µ L de inóculo de P. putida) cada erlenmeyer de capacidade de 250 mL contendo 100 mL de meio de cultivo contendo concentrações conhecidas de biotensoativo a ser ensaiado e incubar por 72 horas, 30 ºC em banho termostatizado com agitação (100 rpm) para manter a temperatura constante e evitar a adesão de bactérias as paredes dos erlenmeyers. A quantidade de carbono orgânico dissolvido (COD) foi avaliada no início e final do experimento (0 e 72h) a fim de verificar a biodegradabilidade do biotensoativo mediante análise em TOC (Analisador de Carbono Orgânico Total, TOC-VCSH, Shimadzu). A eficiência da biodegradação do biotensoativo foi calculada pelo emprego da Equação 4.12 (CARA, 2012):
Equação 4.12
Sendo:
CODi é o carbono orgânico dissolvido no meio líquido no início do cultivo;
CODf é o carbono orgânico dissolvido no meio líquido no final do ensaio;
CODm é a concentração mínima de carbono orgânico que não pode ser metabolizada pelas
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Para compor o meio de cultivo (solução nutriente), foram preparadas duas soluções, uma de compostos inorgânicos e outra de elementos traço, esterilizadas a 121 ºC por 10 minutos.
Os ensaios de biodegradabilidade foram realizados em duplicata, em erlenmeyers de 250 mL, com volume final de 100 mL, adicionando-se aos erlenmeyers:
50 mL do meio de compostos inorgânicos (Tabela 8); 1,0 mL de solução de elementos traço (Tabela 8);
volume de solução de biotensoativo necessária para conseguir a concentração desejada em 100 mL;
água ultra pura (MilliQ) até completar o volume de 100 mL;
Tabela 8 - Composição do inoculo, meio de compostos inorgânicos e elementos-traço.
Inóculo: Meio de compostos
inorgânicos: Elementos traço: 1,0 g/L de extrato de carne; 2,0 g/L de extrato de levedura; 5,0 g/L de peptona; 5,0 g/L de NaCl; 15,0 g/L de ágar* (quando meio sólido). 1,0 g/L de NH4Cl; 1,0 g/L de K2HPO4; 1,0 g/L de KH2PO4; 1,0 g/L de MgSO4.7H2O 0,98 g/L de CACl2.2H2O; 1,0 g/L de MnSO4.H2O; 0,8 g/L de Fe(NH4)2SO4.7H2O; 0,2 g/L de ácido nitrilotriacético
*(quando meio sólido);Fonte: Lechuga et al. (2012); Norma UNE-EN ISO 10712:1996.
Uma vez completada a preparação do meio de cultivo, ajustou-se o pH a 7,0 mediante adição de NaOH 1,0 M. A continuação, inoculou-se cada erlenmeyer com 200 µ L de meio de cultivo previamente preparado com P. putida, incubado em agitador rotatório a 130 rpm), 30 ºC por 24 horas. Por último, incubaram-se os meios de cultivo inoculados em agitador rotatório com banho termostatizado a 130 rpm, 30 ºC, por 72 horas em ambiente escuro.
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O ensaio de biodegradabilidade foi realizado mediante especificações da Norma UNE 55-844-91 (denominado “método estático”) que consiste em inocular uma pequena quantidade de micro-organismos aeróbios, procedentes de uma população mixta e aerada, em um meio aquoso nutritivo de composição química definida apto para o crescimento microbiano (CARA, 2012; RUIZ, 2010). O inóculo utilizado foi obtido na estação de tratamento de águas residuais urbanas “UTE EDAR GRANADA SUR” (Granada, Espanha).
Para compor o meio de cultivo (solução nutriente), foram preparadas quatro soluções distintas, esterilizadas a 121 ºC por 15 minutos. O meio de cultivo é preparado adicionando 0,1% das soluções A, B, C e D em água destilada. Nesse meio aquoso adicionaram-se diferentes concentrações conhecidas do biotensativo a avaliar, considerando- se o volume a ser ensaiado. Utilizou-se erlenmeyers de 2,0 L de capacidade, contendo 1,2 L de meio de cultivo contendo biotensoativo em sua composição. Adicionou-se aos meios, 0,5 ml de inóculo e incubou-se a 25 ºC ± 1 ºC, com uma agitação de 125 rpm em ambiente escuro. Na Tabela 9 descreve-se a composição das soluções utilizadas para preparação dos meios de cultivo para realização dos ensaios de biodegradabilidade.
Tabela 9 - Composição das soluções A, B, C e D empregadas na preparação dos meios de cultivo para realização dos ensaios de biodegradabilidade.
Solução Composição Solução A 8,5 g/L de KH2PO4 21,75 g/L de K2HPO4 33,4 g/L de Na2HPO4.2H2O 1,70 g/L de NH4Cl Solução B 22,50 g/L de MgSO4.7H2O Solução C 27,5 g/L de CaCl2 Solução D 0,25 g/L de FeCl3.6H2O
Fonte: Norma UNE 55-844-91
Analisou-se o consumo de carbono orgânico dissolvido (COD) ao longo do experimento a fim de avaliar a biodegradabilidade. O método tem duração de 28 dias, de acordo com a norma utilizada. As concentrações de biotensoativo estudadas foram: 0 (Branco), 10, 25, 50, 100 e 200 mg/L. Retirava-se uma alíquota de ± 25 ml para a análise da concentração carbono orgânico dissolvido (COD), em TOC nos tempos correspondentes a: 0h, 7h, 24h (1 dia), 31h, 48 h (2 dias), 72h (3 dias), 96h (4 dias), 168h (7 dias), 216h (9dias),
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288h (12 dias), 336h(14 dias), 408h (17 dias), 528h (22 dias), 600h (25 dias) e 672h (28 dias). Calculou-se a porcentagem de carbono orgânico dissolvido residual (% COD Residual) de acordo com a Equação 4.13, a porcentagem de biodegradação final (% Biodegradação Final) através da Equação 4.14 e a percentagem de eficência da biodegradação, mediante o emprego da Equação 4.15. Equação 4.13 çã Equação 4.14
%Eficiência da Biodegradação=( C D 0+ C D C D Branco)- C D t
0 .100 Equação 4.15
Sendo:
CODt– Concentração de carbono orgânico dissolvido no meio líquido em um instante “t”;
CODBranco – Concentração de carbono orgânico dissolvido no meio líquido livre de
biotensoativo (Branco);
COD0– Concentração de carbono orgânico dissolvido no meio líquido no início do ensaio.