Kariyer Bilgi Merkezleri (Berufsinformationszentrum-BİZ)

O tratamento com os compostos C2 e C3 diminuiu significativamente a viabilidade celular em relação ao grupo controle. Por outro lado, a viabilidade das células foi reduzida quando tratadas com PD98059 (50 μM), apenas. Incubando apenas SB203580 (20 μM), não se verificou efeito na redução da viabilidade celular. O co-tratamento dos compostos C2 e C3 com os inibidores da ERK e da p38 MAPK reduziu a viabilidade celular, quando comparando ao controle. Em comparação com o tratamento com os compostos C2 e C3 incubados separadamente, o co-tratamento com o inibidor da ERK (PD98059) diminuiu a viabilidade celular (p<0,05) (Gráfico 16).

Também foi investigado o nível de expressão da proteína ERK e a sua forma fosforilada (p-ERK) pelo ensaio de western blot. O resultado na Figura 16 mostra que os compostos induziram a acumulação da proteína ERK não fosforilada com uma diminuição simultânea da forma fosforilada. Esse resultado sugere que os compostos C2 e C3 atuam inibindo a fosforilação da proteína ERK. Portanto, a via de ERK pode ser um possível alvo no qual os compostos induzem a apoptose nas células HL-60.

Gráfico 16: Participação das MAPKs na inibição da proliferação celular induzido pelos compostos.

As células HL-60 foram tratadas com o PD98059 e SB203580, com ou sem o C2 (A) e o C3 (B) durante 24 horas. A viabilidade das células foi medida pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média, obtidos a partir de três experimentos independentes. ***p<0,001 versus o controle; # p<0,05 comparado com o grupo tratado só com C2 ou C3.

A

B

***

***

***

***

***

***

***

***

Figura 16: Efeito de C2 e C3 na expressão da proteína ERK em células HL- 60.

As células (5x106_{) foram tratadas com as concentrações indicadas durante 24 horas.} As proteínas totais foram extraído, quantificado e 50 μg de proteínas foram colocadas em cada poço do gel. A expressão das proteínas ERK e p-ERK foram analisadas por western blot usando anticorpos específicos. Os valores abaixo das bandas representam o nível de expressão da proteína, relativo à β-actina.

Cont. ETO 10 20 10 20 C2 (μM) C3 (μM) p-ERK 1/2 ERK 1/2 β-actina 0,78 0,67 0,68 0,55 0,69 0,59 0,35 0,50 0,63 0,70 0,53 0,69

Discussão

A química medicinal é dedicada à descoberta e desenvolvimento de novos agentes para o tratamento de doenças. Os compostos inorgânicos continuam a ser importantes na terapêutica, mas as moléculas orgânicas, com atividades farmacológicas cada vez mais específicas, são claramente dominantes. Um dos principais objetivos da química medicinal é o de produzir novos compostos que possam ser usados como medicamentos para a prevenção, o tratamento e a cura das doenças dos seres humanos ou animais (SHANGHAL et al., 2011). Embora a demanda por novos materiais químicos e moléculas biologicamente ativas continue a crescer, os químicos medicinais começaram a explorar o vasto conjunto de compostos potencialmente ativos (AGALAVE et al., 2011). As naftoquinonas podem servir como exemplo desta estratégia, combinando o núcleo 1,4-naftoquinona, com o núcleo 1,2,3-triazol.

Foi nesse contexto que este trabalho, teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de novos compostos triazóis derivados do núcleo 1,4- naftoquinona.

Os testes de citotoxicidade in vitro são importantes para verificar a toxicidade de novos compostos nos estágios iniciais de desenvolvimento do fármaco (PUTNAM et al., 2002). Também são úteis e necessários tanto para definir a citotoxicidade basal, ou seja, a habilidade intrínseca de um composto em causar alterações e morte celular, que é uma consequência do dano às funções celulares básicas, como para definir o limite de concentração para testes in vitro posteriores, Além de também fornecer informações significativas sobre outros parâmetros celulares a serem pesquisados (EISENBRAND et al., 2002).

Neste estudo foi utilizado o ensaio de MTT para avaliar os efeitos citotóxicos dos compostos testados em linhagens celulares cancerígenas HL- 60, K562, K562-Lucena, MCF-7 e HT-29 e também em células normais PBMC.

HL-60 e K562 são as linhagens que mais mostraram sensibilidade aos compostos. A azida que foi usada como precursora para a síntese dos derivados triazóis apresentou uma toxicidade elevada nas células normais PBMC. No entanto, os derivados foram menos tóxicos em PBMC, pois apresentaram IC50 acima de 80 μM. Então, a ciclização do grupamento

funcional azida do composto C1 em triazol parece atenuar a toxicidade dos derivados triazóis resultantes. Além disso, o tipo de grupamento substituído na posição C-4 no anel do triazol é muito importante para a seletividade dos compostos resultantes. De fato, a introdução de um grupamento apolar na posição C-4 resultou em derivados triazóis (C2 e C3), com melhor seletividade para as células cancerosas do que a introdução de um grupamento polar (C4 e C5). Esses resultados sugerem que variar a natureza química do substituinte na posição C-4 do anel triazol é importante para desenvolver novos compostos com melhores atividades citotóxicas.

Neste trabalho, demonstramos que alguns triazóis derivados a partir de 1,4-naftoquinona possuem potencial efeito citotóxico. Vários autores já relataram também, que combinando o núcleo 1,2,3-triazol com outros farmacóforos é possível obter novos compostos com atividades citotóxicas atraentes. Assim, uma série de 1,2,3-triazóis combinados com as podofilotoxinas foram sintetizados, a maioria desses compostos mostraram ser mais potentes do que o etoposidéo em várias linhagens celulares de cânceres humanos (SF-295, A-549, PC-3, Hep-2, HCT-15 e MCF-7) (REDDY et al., 2011). Alem disso, outra série de 1,2,3-triazóis análogos de combretastatina A- 4, preparados por Odlo e colaboradores (2008), mostrou que um dos análogos triazóis exibiu uma atividade citotóxica potente contra várias linhagens celulares de cânceres humanos (MDA-MB231, SK-BR3, SKOV, OVCAR, WM35, WM239) com valores de CI50 na ordem de nanomolar. Outros 1,2,3-

triazóis, que possuem como grupo farmacofórico o híbrido β-lactam-chalcona bifuncionais, foram sintetizados por Singh e colaboradores (2012). Estudos preliminares sobre essas moléculas mostraram que vários desses compostos exibiram atividades citotóxicas.

Outra característica citotóxica que foi utilizada para avaliar nossos compostos foi a análise da integridade da membrana plasmática. Esse ensaio

foi realizado pela citometria de fluxo com o auxilio do fluorocromo IP. Esta análise mostrou que os compostos apresentaram efeito sobre a membrana plasmática, tanto nas células K562, como nas células HL-60. Como a necrose é o mecanismo de morte mais conhecido, implicando em dano a membrana plasmática, os resultados obtidos mostravam este possível efeito citotóxico. Entretanto, não foi o que se observou quando fomos analisar o tipo de morte induzido pelos compostos usando a técnica de dupla marcação com a anexina V e o IP. Assim, o efeito observado estaria ligado ao mecanismo pelo qual os compostos atravessam a membrana plasmática. No trabalho de Hussein et al. (2013) foi demonstrado que as naftoquinonas possuem capacidades de interagir com os fosfolipídios da membrana plasmática e induzir sua desorganização. Isso pode ter acontecido com os nossos compostos. De fato, compostos que são lipófilicos típicos, como os óleos essenciais, também passam através da membrana citoplasmática, afetando a estrutura das diferentes camadas de polissacarídeos e dos fosfolípidos, possibilitando a permeabilização da membrana. A citotoxicidade desses compostos parece incluir tais danos de membrana (BAKKALI et al., 2008). Mas na concentração menor o efeito desses compostos sobre a membrana não permite a indução da necrose, apenas quando a concentração testada for maior (SHARMA et al., 2010).

Tem sido reconhecido que a regulação alterada do ciclo celular é uma indicação do crescimento dos tumores, por isso constitui um importante alvo no tratamento do câncer (GHOBRIAL et al., 2005). A análise do ciclo celular mostrou que no intervalo de 24 horas, os compostos C2 e C3 induziram a parada do ciclo celular nas células K562 na fase S. Na linhagem HL-60 os compostos induziram uma acumulação das células em sub-G1. A fase sub-G1 corresponde a um grupo de células com dano no material genético, ou seja formação de células apoptóticas. Isso sugere uma possivel indução da apoptose pelos compostos C2 e C3 em HL-60. A alteração observada no ciclo celular das células K562 indica que é provavelmente um dos principais mecanismos responsáveis pela ação anticancérigeno dos compostos C2 e C3 nessas células leucêmicas.

Os genes supressores de tumor como p53, p21 e p27 atuam com papel crítico na regulação do ciclo celular (COQUERET, 2003; VOUSDEN & LANE, 2005). O p21 é um dos membros da família das proteínas Cip/Kip; essas proteínas promovem a parada do ciclo celular pelo fato de eles se ligarem e inibirem as CDKs (NATH, 2005). Estas últimas, quando acopladas com suas cíclinas específicas, facilitam a progressão ordenada do ciclo celular. O p21 também é estreitamente regulado no nível transcripcional pelo p53 e, provavelmente, serve como efetor do p53 no controle do ciclo celular (NATH, 2005). Alguns autores relatam que os compostos à base de triazol possuem a capacidade de inibir as proteínas quinases (DHIGE et al., 2012; LE CORRE et al., 2010). Nesse estudo demonstramos que os compostos C2 e C3 após 24 h de incubação com as células K562 induziram o aumento da expressão do gene p21. Isso pode justificar o efeito dos compostos na parada em fase S do ciclo celular em K562.

Várias mudanças na biogênese e na função da mitocôndria estão associadas com a indução da apoptose. A queda do potencial da membrana mitocondrial ocorre antes da fragmentação do DNA em fragmentos oligonucleossomal (MIGNOTTE & VAYSSIERE, 1998). O papel bem esclarecido da mitocôndria no processo da apoptose é a liberação de moléculas pró-morte no interior do citosol. Uma destas moléculas é o citocromo c, que atua nas mitocôndrias como um transportador de elétrons. Uma vez libertado para o citosol, ele ativa Apaf-1, o que por sua vez ativa a caspase-9 e caspase-3 (ZOU et al., 1997). Smac/Diablo é outra molécula pró-morte que tem sido demonstrado ser libertada da mitocôndria durante o processo apoptótico. Esta molécula ativa as caspases, impedindo a inibição dos IAPs (GOYAL, 2001). O fator de indução da apoptose (AIF) é outra molécula libertada da mitocôndria durante a apoptose. Quando liberado da mitocôndria, AIF leva à condensação da cromatina e fragmentação do DNA em larga escala (SUSIN, et al., 1999). Assim, a mitocôndria pode fazer contribuições substanciais para o processo de apoptose, uma vez que todos esses fatores armazenados dentro do espaço intermembranas da mitocôndria são liberados no interior do citosol. A liberação dessas proteínas mitocondriais está no controle das proteínas da família de Bcl-2. Os membros da superfamília de proteínas Bcl-2, que incluem

as anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w) e as pró-apoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bim e Bid), são importantes na permeabilização da membrana externa mitocondrial (KELEKAR & THOMPSON, 1998; WONG & PUTHALAKATH, 2008). A diminuição da expressão do Bcl-2 e/ou o aumento da expressão de Bax, conduz à redução da proporção Bcl-2/Bax, o que leva à disfunção mitocondrial, desencadeando à ativação da cascata de caspase e, consequentemente, submete as células à apoptose (WONG & PUTHALAKATH, 2008). Os compostos C2 e C3 apresentaram efeito na despolarização da membrana mitocondrial na linhagem HL-60. Porém, em K562 os compostos não mostraram ter efeito sobre a membrana mitocondrial. Além disso, a análise da expressão das proteínas Bcl-2 e BAX revelou que nas células HL-60 quando tradadas com os compostos durante 24 horas, mostrou diminuição da expressão da proteína Bcl-2 e paralelamente um aumento da expressão da proteína BAX. Mais ainda, os compostos induziram a liberação do citocromo C no citosol. Com esses dados podemos afirmar que em HL-60 o efeito citotóxico dos compostos é devido à indução da apoptose e implica a via intrínseca.

A indução da apoptose é usada como uma estratégia para o tratamento do câncer. A compreensão da apoptose forneceu a base para novas terapias direcionadas para a quimioterapia do câncer (GHOBRIAL et al., 2005). A apoptose é uma forma de morte celular, que desempenha um papel muito importante durante o desenvolvimento e a homeostasia dos organismos multicelulares. Muitas evidências mostram que o processo de apoptose requer maquinário especializado (GERL & VAUX, 2005; GHOBRIAL et al., 2005).

Os passos iniciais da apoptose incluem a condensação da cromatina, a vesiculação da membrana nuclear e a retração do citoplasma. As etapas tardias incluem a perda da aderência, a degradação do DNA, a condensação do citoplasma e a formação de corpos apoptóticos (COMPTON, 1992; GERCHENSON & ROTELLO, 1992). Uma das técnicas mais usadas para a confirmação da apoptose é a identificação dos fragmentos de DNA (WYLLIE, 1980). Tipicamente, a apoptose envolve a clivagem intra-nucleossomal da cromatina com endonucleases em múltiplos de 180 pb que levam à produção dos fragmentos de DNA típicos (LECOEUR et al., 1997). Para elucidar se os

compostos C2 e C3 diminuem a sobrevivência das células HL-60 e K562 por indução da fragmentação de DNA, o DNA genômico foi isolado a partir das células expostas aos compostos e submetido à eletroforese. O tratamento das células HL-60 levou a fragmentação do DNA como esperado para células em apoptose. Também, foi observado por microscopia de fluorescência a condensação do material genético nas células HL-60 tratadas com C2 ou C3. Nas células K562 não foi observado à fragmentação do DNA. Esses resultados confirmam os obtidos na citometria que mostrou acúmulo das células HL-60 tratadas com os compostos na fase sub-G1. A presença do pico sub-G1 no histograma da distribuição de DNA é indicadora de um grupo de população de células em apoptose (LECOEUR et al., 1997; WYLLIE, 1980).

A fosfatidilserina ocorre exclusivamente na camada interna da membrana plasmática em células viáveis, mas fica exposta na camada externa normalmente durante as fases iniciais de apoptose e antes da perda da integridade da membrana. (BHUSHAN et al., 2006). A externalização da fosfatidilserina foi verificada nas células HL-60 tratadas com os compostos C2 ou C3, o que confirma claramente o acontecimento da apoptose nessa linhagem; enquanto nas células K562 à maior concentração observa-se a indução da necrose.

O mecanismo de citotoxicidade induzida por alguns derivados triazóis foi recentemente relacionado com a indução da parada do ciclo celular e a apoptose (DUAN et al., 2013; MAJEED et al., 2013). Também foi demonstrado que os triazóis derivados do ácido betulínico induziram a apoptose em linhagens celulares de leucemia (THP-1 e HL-60) por meio da perda do potencial de membrana mitocondrial e da fragmentação de DNA (MAJEED et al., 2013). Estes relatos estão de acordo com os nossos resultados, pois foi demonstrado que os derivados triazóis de 1,4-naftoquinona (C2 e C3) são também indutores de apoptose em células HL-60.

A iniciação da apoptose resulta de sinais de duas vias distintas, mas convergentes: as vias extrínseca e intrínseca. A via intrínseca é muitas vezes referida como a morte celular mediada pela mitocôndria, e resulta na ativação do iniciador caspase 9. A caspase 8 é a caspase iniciadora da via extrínseca, que também é conhecida como a via induzida pelo receptor de morte (CHEUNG et al., 2006). A indução da apoptose nas células HL-60, pelos

compostos C2 e C3, pode ser mediada pela via intrínseca, devido os seus papeis na despolarização da membrana mitocondrial, mas também devido de seus efeitos na liberação do citocromo C dentro do citosol.

Nesse estudo a linhagem K562 se mostrou resistente na indução da apoptose. Dessa forma, esta resistência pode estar associada com a expressão da proteína oncogênica BCR-ABL quinase, que é um fator de resistência dessa linhagem de leucemia mielóide crônica na indução da apoptose (MCGAHON et al., 1997).

O estresse oxidativo é considerado uma condição importante para promover a morte celular em resposta a uma variedade de sinais. As EROS podem ativar uma série de vias de sinalização e também são mediadores da apoptose por meio de um mecanismo dependente da mitocôndria (BIRONAITE et al, 2004; FLEURY et al, 2002). Neste contexto, a geração de EROS mitocondrial modifica a permeabilidade da membrana, resultando na despolarização da mitocôndria, a relocalização de BAX, a libertação do citocromo C, e a ativação das caspases (ASCHE, 2005;. FLEURY et al, 2002). Além disso, a geração de EROS também está correlacionada com a diminuição do potencial da membrana mitocondrial. De fato, tem-se demonstrado que as EROS podem induzir a despolarização da membrana mitocondrial, por sua vez levar à ativação da via de apoptose mitocondrial, implicando vários fatores pró- apoptóticos mitocondriais (WANG, 2001). As quinonas são compostos altamente reativos conhecidos para gerar as EROS por meio do mecanismo de redução de elétrons ou por meio da reação com o grupamento tiol. Devido à presença do núcleo quinona na estrutura da plumbagina, a sua atividade citotóxica tem sido atribuída à geração de EROS (KAWIAK et al., 2007).

O composto natural feniletil isotiocianato, um novo agente indutor de EROS, exibe seletividade anticâncer superior e está atualmente sob investigação clínica (Cheung & Kong, 2010; Trachootham et al., 2006; Xiao et al., 2010). Além disso, outro composto natural o Celastrol tem sido mostrado induzir citotoxicidade, causando a acumulação de EROS no ambas as células H1299 do câncer do pulmão e de hepatoma HepG2 (CHEN et al., 2011). Estudos recentes têm demonstrado que as EROS desempenham um papel

importante na apoptose induzida pelo Celastrol (CHEN et al, 2011; SEO et al, 2011).

Nesse estudo, foi revelado que os compostos C2 e C3, nas células HL- 60, induziram o aumento do nível das EROS intracelulares. Esse efeito está na origem de sua citotoxicidade nessa linhagem, já que os experimentos com o NAC revelou que inibindo a produção das EROS, protege as células HL-60 contra os efeitos citotóxicos dos compostos C2 e C3 assim como diminuindo a apoptose demonstrando a associação das EROS com a indução da apoptose.

Estudos demonstraram que os níveis de EROS elevados podem induzir danos celulares (HSEU et al, 2008; LI et al, 2007) e também podem desempenhar um papel importante na mediação da apoptose (GARCIA-RUIZ et al, 1997). Também, foi mostrado que as EROS induzem seletivamente a morte das células cancerosas (KUO et al, 2007; SCHUMACKER, 2006). Por exemplo, HILEMAN et al. (2004) demonstraram que as EROS geradas pelo 2- metoxiestradiol (2-ME), preferencialmente, mata as células leucêmicas humanas sem exibir qualquer citotoxicidade significativa contra linfócitos normais. No entanto, a menor citotoxicidade dos compostos C2 e C3 observado nos PBMC pode ser devido ao fato de eles não induzirem a produção de EROS nessas células.

Investigando a participação da via das MAPKs na citotoxicidade dos compostos C2 e C3 em HL-60, os resultados obtidos mostraram a inibição da fosforilação da ERK. O tratamento das células HL-60 com os compostos C2 ou C3 em 24 horas reduziu a fosforilação da proteína ERK, indicando que os compostos provavelmente atuam inibindo a fosforilação da ERK. Além disso, o co-tratamento com os compostos e o inibidor da ERK (PD98059) aumentou a citotoxicidade induzida pelos compostos, confirmando a idéia de que os compostos inibem a via da ERK. O co-tratamento do inibidor de p38 MAPK não teve diference significativa, comparando com o efeito dos compostos testados separadamente. Esses resultados ainda não são conclusivos para saber o papel do p38 MAPK na indução de apoptose em HL-60, mas sugere que esta via não está implicada no mecanismo de ação dos compostos. Assim são

precisos experimentos complementares para elucidar melhor o papel de p38 MAPK na indução da apoptose pelos compostos C2 e C3, nas células HL-60.

Vários estudos têm mostrado que a ERK ativada fosforila as proteínas anti-apoptoticas, Bcl-2 e Mcl-1, membros da família Bcl-2 e aumenta suas atividades (DIMMELER et al., 1999; DOMINA et al, 2000, TAMURA et al., 2004). A perturbação simultânea de ambos as vias de Bcl-2 e de MAPK aumenta sinergicamente a apoptose em células que apresentam uma ativação constitutiva da MAPK (MILELLA et al., 2002). Esses dados corroboram com os nossos resultados, pois foi mostrado que os compostos C2 e C3 induziram a redução de expressão de Bcl-2, inibiram a fosforilação da ERK e consequentemente levaram as células HL-60 a apoptose.

Dessa forma, este estudo demonstrou que os compostos C2 e C3 podem ser considerados como protótipo de moléculas anti-leucêmicas. Os mapas conceituais esquemáticos para o mecanismo de ação dos compostos nas células HL-60 e K562, são mostrados nas Figuras 17 e 18.

MAPA CONCEITUAL 1

Figura 17: Proposição do mecanismo de ação dos compostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide aguda (HL-60).

MAPA CONCEITUAL 2

Figura 18: Proposição do mecanismo de ação dos comopostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide crônica (K562).

Conclusão

A partir dos resultados desse trabalho, podemos concluir que:

 Os derivados triazóis particularmente os compostos C2 e C3 foram citotóxicos para as linhagens leucêmicas HL-60 e K562.

 Os compostos C2 e C3 foram mais seletivos e apresentaram menor efeito citotóxico nas células normais PBMC.

 Os compostos C2 e C3 induziram a despolarização da membrana mitocondrial, a externalização da fosfatidilserina, a fragmentação do DNA e a liberação do citocromo C, além de diminuir a expressão de Bcl- 2 e aumentar a expressão de BAX, consequentemente levando as células HL-60 à apoptose.

 Na linhagem K562, os compostos induziram o aumento da expressão do RNAm do p21 e a parada do ciclo celular na fase S.

 Os compostos alteraram os níveis de EROS intracelulares seletivamente nas células HL-60. A produção de EROS intracelulares em HL-60 tem um papel importante na citotoxicidade dos compostos C2 e C3.

 Os compostos C2 e C3 podem ser considerados como protótipos de moléculas anti-leucêmicas.

Referências bibliográficas

Agalave, S.G., Maujan, S.R., Pore, V.S., 2011. Click Chemistry: 1,2,3-Triazoles as Pharmacophores. Chemistry-An Asian Journal 6, 2696-2718.

Alison, M.R., 2001. Cancer. Encyclopedia of life sciences, Nature publishing group. 1-8.

Allen, L.F., Sebolt-Leopold, J., Meyer, M.B. (2003). CI-1040 (PD184352): a targeted signal transduction inhibitor of MEK (MAPKK). Seminars in Oncology 30(5), 105–116.

Asche, C., 2005. Antitumor quinones. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 5, 449–467.

Babula, P., Adam, V., Havel, L., Kizek, R., 2007. Naphthoquinones and their pharmacological properties. Ceská a Slovenská Farmacie 56, 114–120.

Bacus, S.S., Gudkov, A.V., Lowe, M., Lyass, L., Yung, Y., Komarov, A.P., Keyomarsi, K., Yarden, Y., Seger, R., 2001. Taxol-induced apoptosis depends