Afin de caractériser au mieux la localisation des mutants d adressage et des canaux sauvages Nav . , des expériences d immunomarquage indirect sont réalisées. Deux stratégies sont adoptées i l une permettant de localiser ces canaux dans des compartiments intracellulaires par co-localisation ii l autre visant à étudier simultanément l expression membranaire des canaux sauvages et l expression totale des canaux Nav1.5 par la technique de la double immunofluorescence.
1- Immunomarquage de co-localisation
L immunomarquage est réalisé à partir de cellules (EK T transfectées ensemencées dans des plaques 24 puits contenant des lamelles de verre de 12 mm de diamètre. Une étape de coating est nécessaire pour favoriser l adhérence des cellules sur ces lamelles qui sont préalablement recouvertes de fibronectine à 4 µg/cm² (Sigma- Aldrich).
Les cellules transfectées depuis 24 h, sont ré-ensemencées à hauteur de 150000 cellules par puits. Le lendemain, les cellules sont lavées avec du PBS avant d être fixées
dans une solution de PBS à 4% de paraformaldéhyde (PFA) (m/v) pendant 10 min. Après rinçage, les cellules sont perméabilisées au Triton X-100 0,1% (v/v) dilué dans du PBS pendant 20 min. Une étape de saturation des sites aspécifiques est réalisée avec du PBS à 5% BSA (m/v) pendant 30 min. Les cellules sont ensuite incubées sur la nuit à 4°C en chambre humide en présence des anticorps primaires dilués dans la solution de saturation (Tableau 7).
Anticorps Primaires Espèce Dilution Fournisseur / Référence Polyclonal Anti-Nav1.5 Lapin 1/1000e Alomone Labs – ASC-005
Polyclonal Anti-GFP Lapin 1/1000e Invitrogen – A6455 Monoclonal Anti-Flag M2 Souris 1/1000e Sigma Aldrich – F1804 Polyclonal Anti-Calnexine Lapin 1/200e StressGen – SPA860
Anticorps Secondaires Espèce Dilution Fournisseur / Référence Alexa Fluor® 488 Anti-Souris Poulet 1/400e Invitrogen – A21200
Alexa Fluor® 488 Anti-Lapin Poulet 1/1000e Invitrogen – A21441 Alexa Fluor® 568 Anti-Lapin Singe 1/400e Invitrogen – A10042 Alexa Fluor® 555 Anti-Souris Chèvre 1/500e Invitrogen – A21422
Tableau 7 : Récapitulatif des anticorps primaires utilisés pour l’immunofluorescence.
Après trois rinçages de 5 min au PBS, les cellules sont incubées avec les anticorps secondaires couplés à un fluorochrome dilués dans la solution de saturation (Tableau 7). †n agent intercalant de l ADN, le To-Pro®-3-Iodide (642/661), est utilisé au 1/1000e pour le marquage des noyaux. Les lamelles sont par la suite montées sur lame avec du milieu de montage Mowiol (Sigma-Aldrich) et sont observées en microscopie confocale à l aide d un microscope inversé F‡ Olympus )X , Tokyo, Japon . L acquisition et l analyse des images sont réalisées à l aide du logiciel Fluoview (Olympus).
2- Double immunofluorescence
La technique de double immunofluorescence présente quelques étapes différentes par rapport à celle de l immunomarquage simple.
Après ensemencement, puis fixation des cellules transfectées, une première étape d incubation en présence de l anticorps souris anti-Flag M2 est réalisée sur les cellules non perméabilisées. Cet anticorps reconnaît alors uniquement l épitope extracellulaire des canaux étiquetés Flag/Nav1.5 sauvages. Les cellules sont alors lavées puis
perméabilisés avant d être incubées une deuxième fois avec un anticorps primaire lapin, Anti-Nav . , qui reconnaît l ensemble des canaux membranaires et intracellulaires. Le reste des étapes de saturation et de détection indirecte sont identiques à celles décrites dans la partie précédente. L incubation avec les anticorps secondaires se faisant à la fois en présence d Alexa Fluor® Anti-Lapin et d Alexa Fluor® Anti-Souris 555 (Tableau 7).
B) Technique de luminométrie ELISA de surface
Cette technique basée sur la mesure de signaux luminescents, est complémentaire aux méthodes de biotinylation de surface et de double immunofluorescence. En effet, elle permet de quantifier l expression membranaire d une protéine d intérêt par rapport à son expression cellulaire totale. De plus, dans nos conditions de transfection, elle présente l avantage d étudier spécifiquement la forme étiquetée « Flag » de Nav1.5/WT et donc de quantifier les expressions membranaire et totale de Nav1.5 sauvage en fonction de la co-expression du mutant Nav1.5/R1432G.
Dans le cadre de ce projet, le protocole utilisé est mis entièrement au point au laboratoire pour des cellules HEK293T transfectées de manière transitoire (Figure 21). Les conditions d ensemencement, de coating, de perméabilisation et d immunodétection sont plus particulièrement optimisées.
Figure 21 : Représentation schématique du protocole simplifié de la technique de luminométrie ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) de surface.
La première étape consiste à trypsiniser les cellules 24 h post-transfection afin de les ensemencer dans une plaque 24 puits opaque Visiplate (Perkin Elmer) préalablement recouverte de fibronectine, comme décrit précédemment. Pour chaque condition de transfection, l ensemencement se fait dans 12 puits à hauteur de 4 x 105 cellules par puits de 1,72 cm².
L expérience débute h post-ensemencement et donc 48 h post-transfection. Les cellules sont lavées précautionneusement dans du PBS avant d être fixées dans une solution de PBS à 4% PFA (m/v) à 37°C pendant 10 min. Après trois lavages de 5 min dans du PBS, la moitié des cellules sont laissées dans la solution saline pendant que les cellules des 6 puits restants sont perméabilisées 20 min à température ambiante dans une solution de PBS additionnée de BSA à 1% (m/v) et de Triton X-100 à 0,1% (v/v). Les cellules sont lavées avec du PBS puis sont incubées dans une solution de saturation de PBS à 5% de BSA (m/v) pendant 1 h à température ambiante. Puis, pour chaque condition de transfection, la moitié des puits (3 perméabilisés et 3 non-perméabilisés) est incubée en présence de l anticorps anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich) dilué au 1/1000e dans la solution de saturation pendant 1 h à 4°C sous agitation modérée, les puits restants étant placés dans la solution de saturation. Après deux lavages dans du PBS, les cellules sont incubées en présence de l anticorps secondaire Anti-souris couplé à la peroxydase (Interchim) dilué au 1/3000e dans la solution de blocage sous agitation à température ambiante, et ce pour l ensemble des puits pour chaque condition de transfection. Après trois lavages avec du PBS, les cellules sont incubées 2 min en présence du substrat SuperSignal ELISA Femto Maximum Sentitivity (Pierce) préparé extemporanément. Les mesures de luminescence à partir de la plaque sont réalisées dans les min suivant l ajout du substrat à l aide du luminomètre Mithras LB (Berthold Technologies). La luminescence, exprimée en unités relatives de lumière (RLU), est intégrée sur 100 ms pour chaque puits.
Du fait de l aspécificité de l anticorps secondaire, le bruit de fond doit être minimisé. Pour cela, le signal mesuré à partir des puits incubés avec les anticorps primaires et secondaires, est soustrait à celui provenant des puits correspondant dans lesquels seuls les anticorps secondaires sont mis en présence des cellules. Ce traitement du signal est effectué à la fois pour les conditions perméabilisées, correspondant à la
quantification de l expression totale de Nav1.5/Flag, et pour les conditions non perméabilisées, correspondant à celle de l expression membranaire de ces canaux.