Para avaliar a influência das condições de cultivo (variáveis de processo) na síntese do biossurfactante efetuou-se um planejamento fatorial fracionado, do tipo fração meia. Foram realizados 10 ensaios em shaker, avaliando-se os seguintes fatores: agitação (100, 150 e 200 rpm), temperatura (30, 35 e 40 ºC), razão de aeração (0,4; 0,6 e 0,8) e concentração da fonte de carbono (diluído 50 % em água destilada, diluído 25 % e sem diluição (SD)) com o objetivo de examinar a influência destas diferentes condições na produção de biossurfactante. A Tabela 4.3 apresenta as condições desses ensaios.
Tabela 4.3 – Condições dos ensaios realizados
Ensaios Condições Agitação (RPM) (1) Temperatura (ºC) (2) RA (3) Meio (%) (4) RTS (%) 1 100 30 0,4 50 31,03 2 100 30 0,8 SD** 28,96 3 100 40 0,8 50 18,14 4 100 40 0,4 SD 4,65 5 200 30 0,8 50 22,31 6 200 30 0,4 SD 30,08 7 200 40 0,4 50 6,28 8 200 40 0,8 SD 6,23 9* 150 35 0,6 25 25,75 10* 150 35 0,6 25 25,50
*Ensaios 9 e 10 – Pontos centrais. **SD – Sem diluição.
Utilizando o programa Statistica 8.0, o Diagrama de Pareto (Figura 4.4) mostra os contrastes significativos sobre a síntese do biossurfactante e as interações entre os fatores, tendo como resposta a porcentagem da redução da tensão superficial (%RTS).
-5,36 7,2 -15,68 -35,76 -38,48 46,56 -154,16 p=,05
Efeito Estimado Padronizado (Valor Absoluto) %RTS (1) Agitação x (4) Meio (4) Meio (1) Agitação (3) R.A. (1) Agitação x (2) Temperatura (1) Agitação x (3) R.A. (2)Temperatura -5,36 7,2
Figura 4.4 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial para um planejamento fatorial de fração meia (24-1)
O único contraste em estudo não significativo, apresentado na Figura 4.4, foi o que representa a concentração da fonte de carbono (Meio), onde sua composição na forma diluída (50 %) ou na modalidade integral, não influenciou na porcentagem da redução da tensão superficial. Uma vez que dos quatro fatores avaliados, apenas três foram significativos, pode- se obter então um planejamento completo para esses três fatores. Dessa forma, utilizou-se o programa Statistica 8.0 para analisar a influência desses três fatores na redução da tensão superficial do meio durante a síntese do biossurfactante. A Figura 4.5 ilustra o diagrama de Pareto obtido para o planejamento fatorial completo 23 com repetição no ponto central.
%RTS -5,36 -15,68 -35,76 -38,48 46,56 -154,16 p=,05
Efeito Estimado Padrão (Valor Absoluto) (2) Temperatura x (3) R.A. (1)Agitação (3)R.A. (1) Agitação x (2) Temperatura (1) Agitação x (3) R.A. (2)Temperatura -5,36
Figura 4.5 – Diagrama de Pareto para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial para um planejamento fatorial completo (23)
Nota-se que quando comparadas as Figuras 4.4 e 4.5, os valores obtidos para os contrastes (Figura 4.4) são os mesmos para os fatores apresentados pela Figura 4.5. A Temperatura é o fator que mais influencia na síntese do biossurfactante. Nesse caso, o aumento da temperatura, ao passar de 30 ºC para 40 ºC reduz em média 19,27 % (ver Tabela 4.4).
Fatores como razão de aeração (R.A.) e agitação também se mostraram significativos. Nesse caso, o aumento dos níveis desses fatores implicou em redução de síntese de biossurfactante, ou seja, a produção é favorecida pelos valores nos níveis inferiores em estudo: 0,4 para a R.A. e 100 rpm para a velocidade de agitação. Ainda, as interações entre agitação e razão de aeração e, agitação e temperatura, também contribuíram para a redução da tensão superficial. A Tabela 4.4 ilustra os efeitos para os fatores significativos.
Tabela 4.4 – Fatores significativos e seus efeitos Fatores Efeito significativo
Agitação -1,96
Temperatura -19,27
Razão de aeração (R. A.) -4,47 Agitação x Temperatura -4,81 Agitação x Razão de Aeração 5,82
Observa-se na Tabela 4.4 que os fatores significativos têm como resposta um efeito acompanhado do sinal negativo, exceto para o fator combinado Agitação x Razão de Aeração. Esse sinal diz respeito ao fato de que ao sair do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) haverá um decréscimo no efeito resposta (%RTS). Para o fator Razão de Aeração, o aumento do volume do meio de 100 mL (R.A. igual a 0,4) para 200 mL (R.A. igual a 0,8), haverá uma diminuição de 4,47 % na síntese do biossurfactante. O aumento de 100 rpm para 200 rpm para o fator Agitação ocasionará em uma diminuição de aproximadamente 2 % na porcentagem da redução da tensão superficial. O fator combinado para a agitação e temperatura também ocasionará uma redução do efeito (4,81 %). Todavia, o fator combinado da agitação e razão de aeração contribui positivamente para o efeito resposta.
Buscou-se ajustar um modelo linear para os dados obtidos, o qual mostrou significância para o intervalo de 95 % confiança. Observa-se na Tabela 4.5 que a variação explicada pela regressão é de 91,44 % (valor obtido pela relação SQR/SQT) para variação
máxima explicável de 99,99 %. O valor para o Fcal (8,63), que relaciona a média quadrática da regressão pela média quadrática dos resíduos (MQR/MQr), comparado ao FTab 5,4 (6,26; no nível de 95 %), apresentou-se superior a 1, indicando uma regressão significativa. Todavia, o modelo linear não se mostrou preditivo, pois o valor do Fcal = 1338,013, que relaciona a média quadrática da falta de ajuste pela média quadrática do erro puro (MQfaj/MQep), apresentou-se muito superior quando comparado ao FTab 2,1 = 199,5 (ao nível de 95%). Assim, a ANOVA diz que o modelo proposto não é útil para fazer previsões, uma vez que a relação entre o Fcal e o FTab é muito maior que 1.
Tabela 4.5 – Análise de variância (ANOVA) para um planejamento 23 em um intervalo de 95% de confiança Fonte de Variação Soma Quadrática (SQ) Nº de graus de liberdade Média Quadrática (MQ) Regressão 904,32 5 180,864 Resíduo 83,7909 4 20,9478 Falta de Ajuste 83,7596 2 41,8798 Erro Puro 0,0313 1 0,0313 Total 989,0164 9
Utilizando o ajuste do modelo linear através da dispersão dos dados em relação aos valores preditos em função dos valores observados (Figura 4.6), observa-se a distribuição dos valores obtidos próximos aos valores preditos, em que os valores preditos pelo modelo são representados pela reta, enquanto que os valores observados são representados pelos pontos.
0 5 10 15 20 25 30 35 Valores Observados 0 5 10 15 20 25 30 35 40 V al o res P red it iv o s
Figura 4.6 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 23 para um modelo linear A fim de avaliar a possibilidade de um modelo quadrático ajustar melhor os resultados obtidos, utilizou-se o teste de curvatura. Observa-se na Figura 4.7 que a curvatura mostra-se
significativa indicando que o modelo quadrático ajustaria melhor os dados. A Figura 4.8 apresenta o Diagrama de Pareto para os valores observados em função dos valores preditos para esse modelo.
0 5 10 15 20 25 30 35 Valores Observados 0 5 10 15 20 25 30 35 V a lo re s P re d it iv o s
Figura 4.7 – Valores observados vs. valores preditos para o planejamento 23 para um modelo quadrático utilizando o teste de curvatura
%RTS -5,36 -15,68 -35,76 -38,48 46,56 51,26857 -154,16 p=,05 (2)Temperatura x (3)R.A. (1)Agitação (3)R.A. (1)Agitação x (2)Temperatura (1)Agitação x (3)R.A. Curvatura (2)Temperatura -5,36
Figura 4.8 – Diagrama de Pareto em um planejamento com curvatura para estimativa dos efeitos sobre a redução da tensão superficial (23)
Após aplicado o teste de curvatura e obtido o diagrama de Pareto, gerou-se as superfícies de resposta para as interações apresentadas. Sabendo-se que a Temperatura foi o efeito de maior significância para a %RTS, a primeira interação envolvendo esse fator é a combinação da Temperatura com a Agitação. A Figura 4.9 apresentada a superfície de resposta para a interação temperatura e agitação.
> 25 < 21 < 16 < 11 < 6
Figura 4.9 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da temperatura e da agitação
Alguns autores citam que a temperatura não é um fator preponderante na síntese do metabólito, porém influencia em sua produção. Batista et al. (2006) estudaram diferentes cepas isoladas do solo e da água do mar na síntese de biossurfactante e de bioemulsificantes. Ao elevar a temperatura de 25 ºC para 35 ºC verificaram que a temperatura não influenciava ou influenciava muito pouco na síntese do metabólito. A temperatura também não foi o principal fator na síntese de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa selvagem para Wei
et al.(2005). Contudo, a temperatura ótima de produção esteve entre 30 e 37 ºC e um
decréscimo foi observado quando a temperatura atingiu a marca de 42 ºC. Os resultados apresentados por esses pesquisadores corroboram com os resultados obtidos para esse trabalho quando se utiliza espécie Pseudomonas. Todavia, nas condições de estudo apresentadas, e de acordo com a análise estatística, a temperatura mostra-se como principal variável de influência na síntese.
De acordo com Wei et al.(2005), a agitação influencia na eficiência da transferência de oxigênio e dos componentes presentes no meio e é considerado fator crucial para o crescimento celular e produção do biossurfactante, principalmente quando a síntese é realizada em Erlenmeyers. Ao analisarem o efeito da agitação na síntese do biossurfactante descreveram que se elevando a rotação de 50 para 200 rpm, a produção do biotensoativo aumentava em 80 %. No presente trabalho, foi observado através do planejamento, que o aumento da agitação reduz em média 2 % a redução da tensão superficial. Entretanto, o efeito da combinação temperatura e agitação também foi significativo, nesse caso, esse efeito combinado reduz em aproximadamente 5% a redução da tensão superficial.
Wei et al. (2005) comentam que uma das características do biossurfactante é a capacidade de formar espumas. A formação de espuma densa causada por emulsificação de ramnolipídeo durante agitação vigorosa (por exemplo, 250 rpm) pode diminuir a eficiência de transferência de gás oxigênio no meio líquido, sendo, portanto, inadequado para a produção de ramnolipídeo em frasco agitados de culturas submersas. No presente trabalho, observou-se uma formação de espuma considerável, conforme ilustrado na Figura 4.10. Dessa forma, esse fenômeno pode ter ocorrido durante a síntese do biossurfactante justificando a diminuição da porcentagem de redução da tensão ao se aumentar a agitação.
Figura 4.10 – Espuma formada pela presença do biossurfactante nos ensaios 6 e 7.
Vale ressaltar que todos os ensaios apresentaram formação de espuma após 12 horas de cultivo. Essa espuma apresentava-se às vezes densa como pode ser visto na Figura 4.11.
Figura 4.11 – Formação de espuma durante o cultivo
A Figura 4.12 ilustra a superfície de resposta para os fatores temperatura e razão de aeração, ratificando o fator temperatura como principal efeito na síntese do biossurfactante. Entretanto, havendo um pequeno acréscimo na porcentagem da redução da tensão superficial
quando a razão de aeração passa a ser 0,4, ou seja, com o volume menor de inóculo no frasco (100 mL) e mais oxigênio. > 30 < 29 < 24 < 19 < 14 < 9
Figura 4.12 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da temperatura e da razão de aeração
O resultado apresentado está de acordo com o publicado por Wei et al. (2005) e também por Chayabruta e Wu (2001) que comentam que a produção de biossurfactante por
Pseudomonas aeruginosa diminui em condições de oxigênio limitante, preferindo um
ambiente de aerobiose.
A Figura 4.13 apresenta a superfície de resposta para a interação razão de aeração e agitação. > 24 < 23 < 21 < 19 < 17 < 15
Figura 4.13 – Superfície de resposta da redução da tensão superficial (%RTS) em função da razão de aeração e da agitação
Observa-se através da Figura 4.13 que o aumento da porcentagem da redução da tensão superficial ocorre quando a R.A. aproxima-se para seu menor valor (0,4) e para uma
agitação de 100 rpm. Esse efeito combinado pode ser explicado pelo fato do micro-organismo preferir meio com oxigênio e de que em uma elevada agitação poderia provocar o cisalhamento das células.