Kanser Kök Hücre (benzeri) Hücrelerinde Moleküler Analizler

Tez çalışmamızda, Hasta 3 (H3) primer kültürü, ve alt grupları olan H3-1: CD44+CD24-HER2+, H3-2:CD44+CD24-HER2-benzeri (stem cell like) hücreler kullanılmıştır (Şekil 1.) İlaçsız kültüre edilen meme kanseri kök hücrelerinde (CD44+_/CD24- _{meme kanseri} kök hücreleri ) ve H3 primer meme kanseri hücrelerinde HER2 reseptörü ifadesi, sitokinlerinin ifadeleri ve metastatik hücre belirteçleri metalloproteazların ifadeleri moleküler yöntemlerle (Flow sitometri ve protein array) belirlenmiştir.

3.1.2.1. Kök hücre CD işaretleri kullanılarak hücrelerin izolasyonu vekKök hücrelerde HER2 ifadesi ile ALDH enzim aktivitesinin belirlenmesi

Hücreler 25 cm2 _{kültür kabında %10 serum ve antibiyotik içeren DMEMF12} besiyerinde üretildikten sonra, hücreler 25 cm2 _{kültür kabından kaldırılarak, trifan mavisi ile} sayılıp 1x106 _{hücre alınarak aynı çözelti ile yıkanmıştır. Kanser kök hücre zarı üzerinde} bulunan (Tirino V., Desiderio V., Paino F., 2012) CD işaretlerine bağlanan floresan monoklonal antikorlar 1 μg/mL olacak şekilde hücreye eklenerek karanlıkta 4°C’de 30 dakika inkübe edilmiştir. PBS ile yıkadıktan sonra FACS Aria III hücre saflaştırma sisteminde analiz edilerek hücreler saflaştırılmıştır. Hücre CD işaretlerine bağlanması için mouse anti-human CD44 FITC, mouse anti-human CD24 PE antikorları (BD Biosciences) kullanılmıştır. CD44+_, CD24- _{hücreler 2 mL DMEM/F12 besiyerine seçilerek kültür kabına alınmıştır. Bu hücreler} meme kanseri kök hücresi olarak adlandırılmıştır. Seçme işlemi sonucunda kontrol amaçlı bir miktar örnek tekrar hücre saflaştırmalı akım sitometri sistemine verilmiş, popülasyondaki CD44+, CD24- hücrelerin saflığı kontrol edilmiştir. Negatif kontrol olarak antikor ile muamele edilmemiş, 10 μg/mL 7AAD ile boyanmış hücreler kullanılmıştır (Ferraros, 2010; Pham, 2012). 7AAD popülasyondaki ölü hücrelerin parçalanmış DNA’sını boyadığı için 7AAD açısından pozitif olan hücreler değil negatif olan canlı hücreler deneye dahil edilmiştir.

Kanser kök hücrelerinin belirlenmesi ve izolasyonunda kullanılan bir diğer işaret de yüksek ALDH aktivitesidir. Bu amaçla ALDEFLUOR kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) kullanılmıştır. Negatif kontrol olarak ALDH inhibitörü (50 mmol/L DEAB) ile muamele edilmiş olan hücreler kullanılmıştır. Bu boyama işlemi için 107 _hücre gerekmektedir. 2 mL tripssin/EDTA (Biochrom) ile 5-6 dakika 37̊ C de bekletilerek kaldirilan hücreler (H3), üzerine 5 ml DMEM-F12 (Biochrom) eklenmiştir. Daha sonra, 1500rpm’de 4 °C de 5 dakika santrifüj edilip, supernatant kısmı uzaklaştırılır. 1 mL PBS Dulbecco

42

(Biochrom) eklenerek hücreler süspande edildikten sonra, 1500 rpm’de 4 °C de 5 dakika santrifüj edilip, supernatant uzaklaştırılır. Tüplere Tablo 3.’deki belirtilen boyalar eklenip, oda sıcaklığında ve karanlıkta 15-30 dakika inkübe edilir. 2 mL PBS Dulbeccoeklenerek hücreler iyice süspande edildikten sonra, 1500 rpm’de 4 °C de 5 dakika santrifüj edilip, süpernatan uzaklaştırılır. Son olarak 500 µL PBS Dulbecco (Biochrom) eklenerek hücreler iyice süspande edildikten sonra, akım sitometrisinde analiz edilir.

Tablo 3.1.2.1.1 7AAD, CD44, CD24 VE HER2 için boyama miktarı

Analiz edilen belirteç Floresan boya Eklenen miktar

Hücre canlılığı (7AAD) PerCP 5 µL

CD44 PE 5 µL

CD24 PE Cy7 2,5 µL

HER2 APC 2,5 µL

Kanser kök hücreleri ve kök hücre olmayan diğer kanser hücrelerinin karşılaştırılabilmesi için 4 farklı hücre grubuna 1 ml DMEM-F12 eklenir. Öncelikle meme kanseri hücrelerinin canlılığı 7-AAD(-) _{hücre populasyonu kapılanarak belirlenmiştir. Daha} sonra meme kanseri kök hücre (benzeri) miktarı bu kapıdan alınan kadranla CD44+_CD24- hücre popülasyonu olarak saptanmıştır. Analizler hücre saflaştırma özelliği olan 8 renkli akım sitometri (FACS Aria III, BD) ile saflaştırılarak kültüre alınmış ve hücreler üretildikten sonra ALDEFLUOR kiti (Aldehit Dehidrojenaz [ALDH] Merkezli Hücre Belirleme Kiti, STEMCELL) kullanılarak bu hücre gruplarındaki ALDH aktivitesi analiz edilmiştir (Tablo3.1.2.1.2).

Saflaştırılmış kök hücrelerde HER2 reseptör ifadesi HER2 reseptör antikor kiti kullanılarak akım sitometri ile değerlendirilmiştir. Kök hücreler HER2 pozitif ve negatif olmak üzere 2 gruba ayrılmıştır (Tablo 4). Popülasyonda yüksek oranda bulunan hücreler saflaştırılıp kültür ortamında öncelikle 24 kuyulu plakalarda üretilmiştir. Kuyuların dolması (% 75- % 80 doluluk/konfluent) ardından hücreler tripsinize edilip 25 cm2 flasklarda üretilmiştir.

43

Tablo3.1.2.1.2 Akım sitometri ile saflaştırılan hücre grupları

CD44+_CD24-

(Kanser Kök Hücre (benzeri) hücreler)

HER2(+)

HER2(-)

CD44+_CD24+

(Kök Hücre Olmayan Kanser Hücreleri)

HER2(+)

HER2(-)

3.1.2.2. Kök Hücre Benzeri Hücrelere Kemoterapi Uygulanması Ve Toksisite Analizleri Trastuzumab ve kombine tedavinin hücrelere sitotoksik etkisi 96 gözlü kültür kaplarında test edilmiştir. İlaçlar yüksek dozdan sırasıyla (trastuzumab: 6,67 µM; paklitaksel: 66,7 µM, karboplatin: 6,67 µM) düşük doza (trastuzumab: 0,013 µM; paklitaksel: 0,13 µM, karboplatin: 0,013 µM) yatay olarak seyreltilmiştir. Vasat kontrolü gözleri hariç her göze 1x104 hücre ektikten sonra 96 saat 37ºC de inkübe edilmiştir. Her göze XTT solüsyonu eklenerek canlı hücrelerin oluşturduğu formazan kristallerini oluşturmak için 4 saat bekletilmiştir. Hücre üremesindeki inhibisyon, kromojenik ürünün 490 nm dalga boyunda ELISA okuyucu (Biotek) ile optik yoğunluğunun belirlenmesi ve IC50 (hücrelerin %50’sinin yaşadığı ilaç konsantrasyonu) değerlerinin hesaplanması ile belirlenmiştir (Kars M.D., 2008).

Primer meme kanseri kök hücre hatlarında paklitaksel, karboplatin ve Trastuzumab(Herceptin) kemoterapötiklerin kombinasyonlarının etkilerinin “checkerboard combination assay” yöntemi ile incelenmesidir (Kars,M.D.2006). Antikanser ilacının konstantrasyonu (A) horizontal (yatay) olarak seyreltilirken, ikinci antikanser ilacın konsantrasyonu (B) vertical (dikey) düzlemde seyreltilmiştir. Medium kontrolü gözleri hariç her göze 1x104 _{hücre ektikten sonra 96 saat 37ºC de inkübe edilmiştir. Her göze XTT} solüsyonu eklenerek canlı hücrelerin oluşturduğu formazan kristallerinin oluşması için 4-10 saat bekletilmiştir. Hücre üremesindeki inhibisyon, kromojenik ürünün 490 nm dalga boyunda ELISA okuyucu (Biotek) ile optik yoğunluğunun Belirlenmesiyle hesaplanmıştır. Primer hücrelere Trastuzumab(herseptin) paklitaksel, karboplatin kombine uygulanmış ve ilaç etkileşimleri belirlenmiştir. İlaç etkileşimleri aşağıdaki ifadelere göre belirlenmiştir:

FICA= IC50 kombine tedavi / IC50A tek başına FICB= IC50B kombine tedavi / IC50B tek başına

44

FIC: fraksiyonel inhibe edici ilaç konsantrasyonu, A: 1. ilaç, B: 2. ilaç, FIX ise fraksiyonel inhibe edici indeks’i ifade etmektedir. FIX = FICA + FICB formülü ile hesaplanır.

FIX <0.5 ise sinerjik etki

FIX 0.5 ve 1 arası ise aditif etki FIX > 1 ise

bağımsız etki

FIX > 2 ise antagonistik etkiyi göstermektedir.

3.1.2.3. Sitokin ve metalloproteazların protein array kullanılarak tayin edilmesi

Protein array tekniği çok sayıda proteinin aynı anda tayin edilebilmesine ve miktarlarının belirlenmesine olanak sağlayan bir sistemdir.

Meme kanseri primer hücrelerinden (H3 ve H3-1/CD44+_CD24-_HER2+_{) protein} izolasyonu yapılmış, protein miktarları BRADFORD yöntemine göre belirlenmiştir.

Protein izolasyonu için 75 cm2 _{flasklarda %75-80 konfluent (kültürün kaptaki %} doluluğu) üretilen 5x106 _{hücre sayılıp, 1 mL RIPA cell lysis buffer (Amresco) eklendikten} sonra 15 dakika buz banyosunda inkübe edilir. Daha sonra 1,5mL’lik santrifüj tüplerine alınıp 14.000g de 15 dakika santrifüj edilir. Süpernatant kısım, protein içermektedir ve 1,5mL’lik santrifüj tüpüne aktarılıp, (-20 ºC de dondurulup saklanabilmektedir) proteinlerin miktar tayini için BRADFORD yönteminden yararlanılmıştır. Bu yöntemde, saflaştırma işleminden sonra hücre lizat örneğinden 10 µL 96 gözlü plakalara üç tekrarlı eklenir. 250 µL commasie reagent eklenip, 30 saniye pipetleme ile karıştırılır. 10 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra, 595nm’ de mikplaka okuyucuda absorbansı ölçülür. Protein konsantrasyonları BSA standart eğrisine göre hesaplanmıştır.

H3 ve H3-1 (HER2 pozitif kanser kök hücreleri) kültürlerde metalloproteaz ve sitokin ifade miktarları protein array kit ve membranları kullanılmıştır(Abcam).

Metalloproteinazlar ve sitokinlerin tespiti için MMP-10 hedef ve Cytokine-23 hedef human antibody array (Abcam) kullanılmıştır. Membranlar eşit miktarda (0,9 mg) total lizat ile hibridize edilmiştir.

45

Bu analiz sırasında Şekil 3.1.2.3.1.’deki yöntem kullanılmıştır. Markerların işaretli kısmı üst sol köşede olacak şekilde yerleştirilir. Oda sıcaklığında 2ml 1X Bloking buffer solüsyonu konulup, 30-45 dakika inkübe edilir. 1X Bloking buffer solüsyonu aspire edilir. H3 ve H3-1 protein lizatları yüklenir ve 1.5-2 saat oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha sonra 4 ºC ye alınıp bir gece beklenir ve ertesi gün solüsyon aspire edilir. 25 ml 1X wash buffer I ile her bir örnek 30 dakika beklenerek yıkama işlemi yapılır. 2 ml 1X wash buffer I koyup 5 dakika oda sıcaklığında çalkalamalı inkübasyona bırakılır. Daha sonra solüsyon aspire edilir. Bu işlemler 3 kez tekrar edilir. 2ml 1X wash buffer II ile 5 dakika beklemeli 2 kez yıkama yapılır. Daha sonra h3 ve h3-1’in üzerine Biotin-Conjugated Anti-Cytokines eklenip oda sıcaklığında 2 saat beklenir ve 4 ºC alınıp bir gece beklenir. Ertesi gün 2 ml 1X wash buffer I koyup 5 dakika oda sıcaklığında çalkalamalı inkübatör yardımıyla yıkama işlemleri yapılır. 1X HRP- conjugated streptavidin hazırlandıktan sonra, inkübe edilir ve solüsyon aspir edilir. Tekrar wash buffer I ile 3 kez yıkama yapılır. Konsantrasyon ayarını kendimiz hazırladığımız 500ul detection buffer karışımından ekleyip, 2dk oda sıcaklığında inkübe edilir (çalkalama yok). Yıkama işlemi 3 kez wash buffer I ile yıkama yapılır ve array membranlarının birkaç saniye aralıklarla 2 dakika boyunca görüntüleme işlemi kemilüminisan olarak (Vilber Lourmat Gel Documentation System) alınır.

46

Şekil 3.1.2.3.1. Abcam MMP ve sitokin protein array protokolü

Array membranları kemilüminisan olarak görüntülenmiş (Vilber Lourmat Gel Documentation System) ve spotlardan Image J programıyla densitometrik analizler yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar karşılaştırılmıştır. MMP panelindeki hedef proteinler MMP- 1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, ve TIMP-4; sitokin panelindedkihedef proteinler ise G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO-alpha, IL-1alpha, IL- 2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-15, IFN-gamma, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIG, RANTES, TGF-beta1, TNF-alpha, ve TNF-beta proteinleridir.

47 4.ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA

Bu projede öncelikli amaç HER2 negatif ve HER2 pozitif meme kanserli hastalardan cerrahi müdahale sırasında elde edilen dokulardan elde edilen primer kültür üretilmiştir ve kök hücreleri akım sitometrisi ile seçerek; kültür ortamında yaşatabilmek olmuştur. Hastamızın H3 (1), H3 (2) ve H3 (3) olarak adlandırdığımız alt grupları üretebildik fakat H3 (4) kanser kök hücresi olmayan alt grubu üretilemedi. Üretilebilen alt gruplarımız ve primer kanser hücresinde Trastuzumab'ın etkinliği değerlendirildi ve kombinasyon kemoterapinin kök hücrelerde meydana getirdiği moleküler etkileri araştırıldı. Bu etkiler kök hücrelerde HER2 reseptörü, sitokinler ve metastaz açısından önemli olan metalloproteinaz ifadeleri ve proliferatif etki yönünden değerlendirildirildi. Böylelikle HER2 negatif hasta grubundaki tedavi cevabını belirleyebilerek belirteçlerin neler olduğu konusunda literatüre önemli bir katkı sağlamak hedeflendi.