Kamu Düzenine Aykırılık

O espectro de infravermelho pode ser utilizado para a identificação de moléculas, como uma impressão digital76. Os aminoácidos, constituintes das proteínas, existem como íons dipolares (também chamados zwitterions), pois contêm um grupo básico (-NH2) e um

grupo ácido (-COOH)18. Logo, estes compostos exibem espectros contendo combinações de grupos carboxilatos e aminas primárias. Aminoácidos podem apresentar vibrações de estiramentos NH3+, deformações angulares N-H (assimétrica/simétrica) e estiramentos COO-

(assimétrico/simétrico). Grupamentos também importantes para o estudo espectral das proteínas são as amidas. As bandas de amida, principalmente amidas primárias, podem contribuir de maneira essencial para a informação estrutural contida nas bandas de infravermelho77. Estas informações são úteis para o estudo de interações de proteínas, pois o aparecimento e desaparecimento das bandas, assim como a variação de intensidade e deslocamento podem fornecer informações relevantes para o entendimento de fenômenos de interesse.

No sistema receptor-ligante utilizado neste trabalho, foram coletados espectros de infravermelho no modo de reflexão. Os espectros de reflectância podem fornecer informações tanto qualitativas quanto quantitativas. Para este trabalho, o estudo é essencialmente qualitativo em virtude da dificuldade da análise precisa das interações receptor-ligante, resultantes do aparecimento e deslocamento das bandas dos grupos presentes nas moléculas avaliadas, como será exposto a seguir. É importante mencionar novamente que os filmes adsorvidos são extremamente finos, daí a dificuldade em se obter espectros com boa relação sinal/ruído.

Na Figura 19 é possível observar as bandas de reflexão dos espectros referentes à SAM de tiol sobre o substrato de vidro recoberto com ouro (AuSH), à monocamada de TRβ1- LBD diretamente sobre a superfície de ouro (AuTR) e à monocamada de TRβ1-LBD sobre a SAM de tiol (AuSHTR). Nesta figura estão destacadas algumas bandas, as quais também são descritas na Tabela 1. No espectro AuSH é possível observar que não ocorrem bandas de grande intensidade, o que é coerente com a literatura76,78. Para compostos contendo o grupamento S-H, as fracas reflexões podem ocorrer em 2590 - 2540 cm-1. O grupo metileno ligado ao átomo de enxofre (CH2-S) pode originar bandas, também de fraca intensidade,

também a deformações angulares (1435 - 1410 cm-1). Para o espectro de AuTR, foram observadas as bandas características de amida dos resíduos de aminoácidos que compõem a região protéica LBD de TRβ1, conforme destacadas na Figura 19. Geralmente76, amidas primárias e secundárias apresentam bandas largas referentes às reflexões C=O na faixa de 1640 - 1620 cm-1. Desta forma, pode ocorrer sobreposição (“overlap”) das bandas referentes a este grupamento juntamente com deformações angulares N-H, neste caso, em torno de 1800 cm-1. Estiramentos N-H são observados por volta de 3475 cm-1, os quais também foram destacados, juntamente com estiramentos C-N em 1400-1500 cm-1.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 4000 Número de Onda (cm-1₎ Estira mentos CH2-S Assimétricos/simétricos Deforma çã o CH2-S Estira mentos N-H Estira mentos C-H Estira mentos C-N Sobreposiçã o: Deforma çã o a ngula r N-H e esira mento C=O N-H a ssocia do em

a mida s

Estira mentos C-O

Estira mentos C-N R ef le ct â n ci a ( % )

Figura 19 - Espectros de infravermelho referentes a: SAM de tiol sobre o substrato de vidro recoberto com ouro (AUSH); região LBD da molécula de TRβ1 sobre substrato de vidro recoberto com ouro (AuTR) e SAM de tiol sobre o substrato de vidro recoberto com ouro contendo TRβ1 LBD imobilizada sobre esta (AUSHTR).

A imobilização de TRβ1-LBD foi realizada como ilustrado na Figura 16, ou seja, após a preparação do substrato com a SAM de tiol (11-AMU), uma solução da proteína foi

depositada sobre o substrato por casting (durante 1 h). O espectro de FTIR oriundo desta imobilização é o AuSHTR, mostrado na Figura 19. Comparando-se os espectros da região LBD-TRβ1 imobilizados diretamente sobre a superfície de ouro (AuTR) e sobre ouro funcionalizado com tiol (AuSHTR), foi possível constatar variações nas intensidades dos sinais vibracionais, além da maior definição no aparecimento das bandas referentes às interações intra e intermoleculares.

Ainda para o espectro de AuTR, foi possível observar o aparecimento de bandas características de estiramentos C-H na região de 3050 – 2600 cm-1, as quais não tiveram as mesmas intensidades no espectro de AuSHTR. Isso ocorre em função da quantidade de material que interagiu com a superfície do substrato. A adsorção da região LBD da proteína TRβ1 é maior na ausência da monocamada de tiol, uma vez que há maior quantidade de átomos de Au disponíveis na superfície do substrato responsáveis pelas interações não específicas com a proteína. Estas interações resultam da atração entre resíduos de aminoácidos contendo átomos de enxofre, e os átomos de ouro presentes no substrato. Com a funcionalização da superfície, a molécula de TRβ1-LBD, embora aparentemente interaja com menor intensidade com o substrato, interage fortemente com a SAM de tiol, o que ocorre preferencialmente pela cauda de histidina, com os grupos carboxílicos do tiol. Esse efeito possivelmente confere à molécula uma orientação, melhorando o acesso do ligante ao sítio ativo da proteína. Além disso, a funcionalização minimiza as interações não-específicas, aumentando a seletividade nas medidas de detecção dos HTs, como será discutido adiante.

Dentre as bandas de maior intensidade para a proteína imobilizada, cabe ressaltar a sobreposição de bandas ocorrida na região entre 1700 e 2000 cm-1, e também os estiramentos C-N das amidas em torno de 1500 cm-1. As diferenças dos espectros referentes à região LBD de TRβ1 ancorado sobre ouro, ou sobre a monocamada de tiol podem indicar diferenças conformacionais da biomolécula ancorada.

A análise da Figura 19 revela ainda um deslocamento da banda atribuída aos estiramentos C-N. Essa banda, localizada em cerca de 1500 cm-1 para AuTR, parece deslocar para 1400 cm-1 no AuSHTR, indicando o efeito que a SAM de tiol exerce sobre a estrutura da proteína. Também para o espectro de AuTR a banda referente aos estiramentos N-H aparece em aproximadamente 3380 cm-1, sendo suprimida no espectro de AuSHTR. Esta característica também é observada para as bandas na região entre 2800 e 3000 cm-1 resultantes dos estiramentos C-H, que apresentam menor intensidade no espectro de AuSHTR em relação ao AuTR.

Os espectros contendo os ligantes específicos adsorvidos sobre a superfície de TRβ1- LBD estão apresentados na Figura 20. Estes sistemas foram designados como AuSHTRT3, AuSHTRT4, AuSHTRTRIAC e AuSHTRGC-1, dependendo do ligante que interagiu com a camada receptora de TRβ1-LBD. Os espectros de reflexão obtidos para estes sistemas não possuem boa relação sinal/ruído, impossibilitando uma análise mais precisa acerca da natureza das interações envolvidas.

Os espectros do receptor nuclear TRβ1-LBD (AuSHTR) imobilizado, e aqueles contendo os ligantes específicos adsorvidos, permitiram analisar diferenças de reflexão de radiação indicando a interação receptor-ligante. Os estiramentos N-H exibem reflexões referentes a deformações angulares N-H entre 1540 e 1640 cm-1, de intensidade média a forte, para aminas e amidas primárias, ou entre 1490 e 1580 cm-1, de intensidade fraca a ausente para aminas e amidas secundárias. Estas bandas não foram observadas claramente nos espectros da Figura 20, provavelmente por serem suprimidas pela banda em 1560 cm-1 de anéis aromáticos dos HTs e dos análogos TRIAC e GC-1.

A região em torno de 1700 cm-1 apresenta várias bandas, as quais estão destacadas na Figura 20 como sobreposição das deformações angulares N-H e estiramentos C=O, típicos dos aminoácidos. Ressalta-se que o grupo C=O está presente também nas moléculas de ligantes, nos grupos carboxila. Para os filmes contendo os ligantes, um leve deslocamento para maiores números de onda são observados para o C=O, quando comparado ao espectro de AuSHTR. Para este último, foi evidenciada na figura a banda localizada em 1680 cm-1, a qual equivale a, aproximadamente, 1700 - 1710 cm-1 nos espectros contendo os ligantes. Este deslocamento é outro indício da interação dos HTs e dos análogos sintéticos à molécula receptora TRβ1.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 4000

Número de Onda (cm-1₎

Estira mentos C-H de a nel a romá tico

Estira mentos O-H a ssocia dos com liga ções de H

Deforma ções a ngula res de H a dja centes – a nel a romá tico

R ef le ct â n ci a ( % ) Sobreposiçã o: Deforma çã o a ngula r N-H e esira mento C=O N-H a ssocia do em

a mida s

Estira mentos C-O

Estira mentos C-N 1680

1700

1710

Figura 20 - Espectros de infravermelho para os filmes nanoestruturados contendo TRβ1-LBD (adsorvidos sobre monocamada de tiol), novamente ilustrado, e após interagir com HTs: Legenda: AuSHTR – superfície de ouro e monocamada de tiol contendo TRβ1-LBD imobilizado, AuSHTRT3 – AuSHTR contendo o ligante T3, AuSHTRT4 – AuSHTR contendo o ligante T4, AuSHTRTRIAC – AuSHTR contendo o ligante TRIAC e AuSHTRGC-1 – AuSHTR contendo o ligante GC-1.

Outro indício da presença das moléculas de ligantes adsorvidas sobre a camada biorreceptora, e talvez o mais importante para esta análise, é a região em 3100 cm-1, a qual é característica de estiramentos C-H originados pelas vibrações típicas de anel aromático. Esta região aparece bastante diferenciada quando comparada ao espectro de AuSHTR, na ausência dos HTs e dos análogos sintéticos. Vale ressaltar ainda que para os filmes contendo os HTs T3 e T4 ocorre um aumento da intensidade da banda em 3700 cm-1 referente aos grupos OH, que podem ser oriundos tanto dos grupos fenólicos (do ligante), quanto dos grupos

carboxílicos (dos ligantes ou da proteína). A Tabela 1 sumariza as bandas de reflexão dos compostos analisados, juntamente com suas respectivas atribuições.

Tabela 1 - Atribuição proposta para as bandas referentes às SAMs de AuTR, AuSH, AuSHTR, AuSHTRT3, AuSHTRT4 e AuSHTRTRIAC76,78.

Número de Onda (cm-1) Atribuição proposta das bandas

3600 Estiramentos de O-H de álcool, pertencente a grupo fenol, sobrepostos com estiramentos O-H de ácido

3475 Estiramentos do grupo N-H

3100 Estiramentos C-H de anel aromático 3050 – 2600 Estiramentos C-H

2948 - 2922 Estiramentos assimétricos do grupo CH2-S

2878 - 2846 Estiramentos simétricos do grupo CH2-S

1700 – 2000 Sobreposição de bandas referentes às reflexões C=O (1.640 - 1.620 cm-1) com deformações angulares N-H, (1.800 cm-1)

1600 - 1450 e 690 - 800 Estiramentos C=C de compostos aromáticos

1500 Estiramentos C-N

1435 - 1410 Deformações angulares do grupo CH2-S

1420 e 1300 - 1200 Estiramentos de C-O devido a ácidos carboxílicos resultantes do acoplamento da deformação angular no plano da ligação O-H e a deformação axial de C-O

1400-1500 Estiramentos do grupo C-N

Os espectros para o receptor nuclear TRβ1-LBD imobilizado (AuSHTR) e aqueles contendo os ligantes específicos adsorvidos (AuSHTRT3, AuSHTRT4, AuSHTRTRIAC e AuSHTRGC-1) comprovam a presença do receptor no filme. Para o caso dos HTs e dos análogos sintéticos, a relação sinal-ruído dos espectros não foi boa, devido à pequena quantidade de material adsorvido. Além disso, a reflexão para amostras sólidas, neste caso um filme, não é um fenômeno exclusivamente de superfície, mas uma síntese de espalhamento, transmissão e interações de absorção da radiação no volume de filme. A superfície do filme

também influencia nestes parâmetros, pois não é homogênea, contendo regiões orientadas aleatoriamente, ocasionando a reflexão da radiação em todas as direções75. Estes parâmetros, associados à natureza monocamada do filme, dificultam um estudo mais preciso deste sistema receptor-ligante, através de espectroscopia de FTIR.