Brokoli suyu ve konsantre edilen permeat örnekleri arasında doğrudan karşılaştırma yapabilmek amacıyla, konsantre edilen örnekler yapılacak kalite analizleri öncesinde ön işlem görmüş brokoli suyu (kontrol) örneğine göre seyreltilmiştir. Sulforafan, fenolik bileşikler, L-askorbik asit ve organik asit analizi Agilent 1200 sistem Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) cihazı (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HPLC sistemi kuaterner pompa (Agilent, G1311C), otomatik örnekleyici (Agilent G1329B), kolon termostatı (Agilent, G1316A) ve UV-dedektörden (Agilent, G1315D) oluşmaktadır.
0.020 g
Besleme
T T
T T
Peristaltik pompa Peristaltik pompa
Terazi Permeat
Isı Değiştirici Isı Değiştirici
3.2.3.1. pH ve Toplam Asitlik Tayini
Brokoli suyu örneklerinin pH değerleri pH metre (Mettler-Toledo SG-2 SevenGo, Switzerland) kullanılarak belirlenmiştir. Toplam asitlik tayininde, örnekler 0,1 N NaOH ile pH 8,1’e kadar titre edilmiş ve harcanan baz miktarından yararlanarak örneklerin toplam asitlikleri hesaplanmıştır. Brokoli suyunda baskın asit malik asit olduğundan, sonuçlar g malik asit/100 mL olarak ifade edilmiştir.
3.2.3.2. Renk Analizi
Örneklerin rengi, Minolta CM 3600d spektrofotometre cihazı (Konica Minolta Sensing, Inc., Osaka, Japan) kullanılarak belirlenmiştir. L* değeri örneklerin parlaklık ve açıklık değerlerini göstermektedir (0=siyah, 100=beyaz). a* değeri kırmızı/yeşil, b ise sarı/mavi koordinatlarını göstermektedir. Örnekler arasındaki toplam renk farkını ifade eden ΔE değeri ise aşağıdaki denklem yardımıyla hesaplanmıştır:
𝛥𝐸 ∆𝑎∗ ∆𝑏∗ ∆𝐿∗ (3.10)
3.2.3.3. Toplam Fenolik Madde Analizi
Toplam fenolik madde analizi Spanos, Wrolstad & Heatherbell (1996) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Yöntemin prensibi, fenolik bileşiklerin bazik ortamda Folin-Ciocalteu ile kompleks oluşturması ve oluşan mavi rengin spektrofotometrede ölçülmesine dayanmaktadır. Brokoli suyu belirli bir oranda seyreltilerek 0,45 μm gözenek boyutunda naylon filtreden geçirilmiştir. Seyreltilmiş örnekten 1 mL alınarak üzerine 5 mL 0,2 N Folin-Ciocelteu reaktifi ve 4 mL doymuş sodyum karbonat (75 g/L) ilave edilerek vorteksle karıştırılmıştır. Elde edilen bu karışım 50 °C’de su banyosunda 5 dk bekletildikten sonra hemen soğutulmuştur. Karışımın absorbansı spektrofotometrede (Shimazdu, Japan) 760 nm dalga boyunda belirlenmiştir. Brokoli suyu örneklerinde bulunan toplam fenolik madde miktarı, farklı konsantrasyonlarda (20-120 mg gallik asit/L) hazırlanan standart gallik asit eğrisinden elde edilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. Gallik asit kalibrasyon eğrisi Şekil 3.4’de verilmiştir. Sonuçlar mg gallik asit/L olarak ifade edilmiştir.
Şekil 3.4. Gallik asit kalibrasyon eğrisi
3.2.3.4. Toplam Antioksidan Aktivite Analizi
Brokoli suyu örneklerinde toplam antioksidan aktivite analizi Troloks eşdeğeri antioksidan aktivite (TEAC) yöntemine göre saptanmıştır (Re vd., 1999). ABTS radikali (ABTS*+), 7 mM 2,2'-azinobis(3-etilbenzothiazolin–6-sülfonik asit) (ABTS) ile 2,45 mM potasyum persülfatın (K2S2O8) karıştırılması ve elde edilen karışımın 16 saat süreyle karanlıkta ve oda sıcaklığında bekletilmesi ile oluşturulmuştur. Yöntemin prensibi, oluşan ABTS*+ radikalinin örnekte bulunan antioksidan aktivite gösteren bileşenler tarafından inhibisyonuna dayanmaktadır. ABTS*+ radikal çözeltisi 734 nm’de absorbansı 0,70 (±0,02) olacak şekilde etanol ile seyreltilmiştir. 3 mL ABTS*+ radikal çözeltisi ile 30 μL metanol ekstraktı karıştırılıp 6 dk sonundaki absorbans kaydedilmiştir. Trolox kalibrasyon eğrisi Şekil 3.5’de verilmiştir. Toplam antioksidan aktivite mmol Trolox/L (mM) cinsinden ifade edilmiştir.
y = 0,0096x R² = 0,9945 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 20 40 60 80 100 120 140 Absorbans
Şekil 3.5. Troloks kalibrasyon eğrisi
3.2.3.5. Fenolik Bileşiklerin HPLC ile Belirlenmesi
Brokoli suyunda fenolik madde analizi dos Reis vd., (2015) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Brokoli suyundaki fenolik bileşikler daha çok glikozit formunda bulundukları için, örneklere HPLC analizi öncesinde belirli sıcaklık ve sürede asit hidrolizi uygulanarak glikozidik bağlar hidrolize edilmiştir. Bu amaçla belirli bir miktar brokoli suyuna sulu metanolde hazırlanmış (%50, v/v) 10 mL 1,2 M HCl ve 2 mg askorbik asit eklenmiştir. Bu karışım 90 °C’de 3 saat bekletilerek asit hidrolizine tabi tutulmuştur. Süre sonunda örnek 0,45 μm gözenek boyutuna sahip politetrafloroetilen (PTFE) şırınga filtre yardımıyla süzülüp HPLC’ye enjekte edilmiştir.
Mobil faz olarak 0,5 mL/dk akış hızında metanol (A) ve seyreltik trifloroasetik asit (B, 300 μL/L) kullanılmıştır. Fenolik madde analizinde kullanılan gradient akış programı Çizelge 3.3’de verilmiştir. Ayrım C18 ters faz kolon kullanılarak 25 °C’de gerçekleştirilmiştir. Kromatogramlar fenolik asitler için 270 nm ve flavonoidler için 360 nm dalga boyunda ayrı ayrı kaydedilmiştir. Fenolik bileşiklerin tanımlanmasında; örnek ve standart bileşiklerin alıkonma süreleri ile spektrumları karşılaştırılmıştır. Standart bileşiklerin ölçüm ve tespit limitleri standart bileşiklere ait kalibrasyon eğrileri kullanılarak tespit edilmiştir. Asit hidrolizi öncesinde, kaffeoil-kuinik asit türevleri
y = 0,3356x R² = 0,9914 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Absorbans Troloks konsantrasyonu (mM)
klorojenik asit cinsinden, flavonoidler rutin cinsinden ve sinapik ve ferulik asit türevleri ise sinapik asit cinsinden hesaplanmıştır. Asit hidrolizi sonrasında ise örneklerde kamferol ve kuersetin aglikonları saptanmıştır. Fenolik bileşiklerin miktarları standart kalibrasyon eğrileri kullanılarak hesaplanmıştır.
Çizelge 3.3. Fenolik madde analizinde kullanılan gradient akış programı
t, dk Mobil Faz A, % Mobil Faz B, %
0 30 70 15 30 70 20 40 60 40 50 50 60 50 50 75 55 45 76 30 70 90 30 70 3.2.3.6. Sulforafan Analizi
Brokoli suyu örneklerinde sulforafan analizi Sivakumar, Aliboni & Bacchetta, (2007) tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Buna göre; belirli miktarda örnek 3 mL diklorometan (DCM) ile karıştırılarak 11068 g’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Elde edilen diklorometan ekstraktı katı faz ekstraksiyona (solid phase extraction, SPE) tabi tutulmuştur. Bu amaçla silika bazlı SPE kartuş (Supelco, 3 mL, Sigma St. Louis, MO, USA) kullanılmıştır. 3 mL DCM ile ön şartlandırılmış kartuştan diklorometan ekstraktı geçirilmiştir. Daha sonra kartuş 3 mL etil asetat ile yıkanarak, örnek 3 mL metanolde toplanmıştır. Elde edilen metanol ekstraktı azot gazı altında kurutularak, kalıntı 1 mL asetonitrilde çözündürülmüştür. Asetonitril fazı 0,45 µm gözenek boyutunda naylon filtreden geçirilerek HPLC sistemine enjekte edilmiştir.
HPLC’de ayırım C18 (5 µm, 250x4,6mm) kolon kullanılarak 36 °C’de ve 202 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Mobil faz asetonitril:su (30:70) karışımı olup akış hızı
0,5 mL/dk’dır. Standartlar 0,50-25,0 mg/L konsantrasyon aralığında hazırlanarak sulforafana ait kalibrasyon eğrisi çizilmiştir (Şekil 3.6).
Şekil 3.6. Sulforafan kalibrasyon eğrisi
3.2.3.7. Askorbik Asit Analizi
Askorbik asit analizinde Kurilich vd., (1999) ve Sanchez-Vega, Elez-Martínez & Martín-Belloso (2015) tarafından önerilen yöntemler modifiye edilerek kullanılmıştır. Brokoli suyu ve %1’lik m-fosforik asit çözeltisi 1:1 oranında karıştırılarak 4 °C’de 11068 g’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Supernatant kısmından 1 mL alınarak üzerine 1 mL %5’lik dithiothreitol (DTT) ilave edilip %1’lik m-fosforik asit ile hacim 10 mL’ye tamamlanmıştır. Karışım 0,20 µm gözenek boyutunda naylon filtreden filtre edilerek HPLC sistemine enjekte edilmiştir. Askorbik asit analizinde kullanılan HPLC çalışma koşulları Çizelge 3.4’de verilmiştir.
Çizelge 3.4. Askorbik asit analizinde kullanılan HPLC çalışma koşulları
Kolon Zorbax PLRP-S (5 µm, 250x4,6mm)
Kolon Sıcaklığı 30 °C
Mobil faz Asetonitril:0,05 M KH2PO4 (70:30)
Mobil faz akış hızı 0,4 mL/dk
Dalga boyu 220 nm
Çıkış zamanı 7,4 dk
3.2.3.8. Organik Asit Analizi
Organik asit analizi için brokoli suyu örnekleri 0,01 N H2SO4 ile uygun oranda seyreltilmiştir. Seyreltilen örnekler 11068 g’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Elde edilen supernatant 0,45 µm gözenek boyutunda naylon filtreden filtre edilerek HPLC sistemine enjekte edilmiştir. Organik asit analizinde kullanılan HPLC çalışma koşulları Çizelge 3.5’de verilmiştir.
Çizelge 3.5. Organik asit analizinde kullanılan HPLC çalışma koşulları
Kolon MetaCarb H Plus kolon (300x7,8mm)
Kolon Sıcaklığı 60 °C
Mobil faz 0,01 N H2SO4
Mobil faz akış hızı 0,4 mL/dk
Dalga boyu 210 nm