No teste de aceitação foram avaliados os atributos de aparência, cor, aroma, textura, sabor e impressão global, sendo utilizada uma escala hedônica estruturada mista de nove pontos, com as extremidades 9 (gostei muitíssimo) e 1 (desgostei extremamente) (Anexo 1) (STONE; SIDEL, 1993). As amostras foram apresentadas em blocos completos casualizados, codificadas com algarismos de três dígitos e de forma monádica. A equipe foi composta por 60 consumidores não treinados, habituados ao consumo de salame. Todos os voluntários do estudo concordaram com o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FCF – UNESP Araraquara (n° 0657.4912.2.0000.5426) (Anexo 2). Os testes de aceitação foram realizados no T30, final do período de maturação e cada 30 dias de armazenamento (T60, T90 e T120) no Laboratório de Análise Sensorial da FCFAr – UNESP.
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No teste de intenção de compra, utilizou-se uma escala de 5 pontos (1 = certamente não compraria, 2 = provavelmente não compraria, 3 = tenho dúvidas se compraria, 4 = provavelmente compraria, 5 = certamente compraria) (Anexo 3) (MEILGAARD; CIVILLE; CARR, 1999).
Análise Descritiva Quantitativa
Os candidatos pré-selecionados (30 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, Anexo 4), por meio de testes triangulares aplicados à análise sequencial de Wald (AMERINE; PANGBORN; ROESSLER, 1965; MEILGAARD; CIVILLE; CARR, 1999), realizaram o levantamento dos termos descritores sensoriais dos embutidos cárneos através do método rede (Repertory Grid Kelly’s Method - MOSKOWITZ, 1983). As fichas de avaliação foram montadas com os termos descritores que melhor caracterizaram as amostras, sendo utilizadas escalas não estruturadas de nove centímetros, ancoradas nos pontos extremos pelos termos: “fraco”, “pouco”, “nenhum” ou “forte”, “muito”.
A seguir foi realizada a definição dos termos descritores, a escolha de referências para cada extremo da escala e o treinamento dos julgadores. A seleção da equipe definitiva foi realizada com base no poder de discriminação entre as amostras (p<0,30), repetibilidade (p>0,05) e concordância entre os julgadores (DAMÁSIO; COSTELL, 1991). As amostras foram apresentadas para análise codificadas com algarismos de três dígitos, aleatorizadas, de forma monádica e com quatro repetições, no produto pronto para consumo (T30).
Todas as etapas da AQD foram realizadas no Laboratório de Análise Sensorial da FCFAr – UNESP.
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Segunda etapa: Avaliação do embutido probiótico em um sistema de cultura contínuo -
Simulador do ecossistema microbiano humano (SEMH)
O simulador do ecossistema microbiano humano (SEMH), localizado no Laboratório de Microbiologia de Alimentos da FCFAr – UNESP, é formado por cinco reatores sucessivos e conectados, que representam os diferentes segmentos do trato gastrintestinal humano, com seus respectivos valores de pH, tempo de residência e capacidade volumétrica (Figura 1). Os cinco reatores foram continuamente agitados por um agitador magnético e mantidos a temperatura de 37ºC por meio de um termostato. O meio foi mantido em anaerobiose, através da injeção diária de N2 durante 30 minutos e o pH adequado de cada porção do trato foi controlado automaticamente pela adição de NaOH 1M ou HCL 1M (POSSEMIERS et al., 2004; MOLLY et al., 1994).
Cada reator possui oito portas: entrada e saída do meio, amostragem da fase líquida e do espaço ocupado pelos gases, pH-eletrodo, pH-controle (ácido e base) e injeção de gases. Para a transferência sucessiva das amostras entre os reatores foram utilizadas bombas peristálticas. As bombas nomeadas de a-d trabalharam de forma semi-contínua e o restante (e-g) (Figura 3), de forma continua (MOLLY et al., 1994), simulando o trato gastrintestinal.
A passagem do alimento pelo intestino delgado foi simulada pelo Reator 2 através da adição de 60 ml de suco pancreático e biliar artificiais, a uma taxa de 4mL/min, por 15min, duas horas após a adição do embutido cárneo probiótico (MOLLY; WOESTYNE; VERSTRAETE, 1993; POSSEMIERS et al., 2004).
No início do experimento, os últimos três reatores foram inoculados com amostra de fezes de um doador adulto voluntário - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, Anexo 5), que não havia utilizado antibiótico por um período de dois anos antes do início do experimento. A amostra de fezes (60g) foi diluída dez vezes com tampão fosfato (0,05 mol/L de Na2HPO4, 0,05 mol/L de NaH2PO4 e 0,1% de Na-thioglicolato; pH=6,5), agitada em stomacher (10 minutos) e centrifugada (5
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minutos a 3000 rpm). Um volume de 40 mL do sobrenadante obtido foi adicionado aos reatores 3, 4 e 5.
Tabela 3. Valores de volume, tempo de residência e pH estabelecidos em cada um dos reatores do simulador do ecossistema microbiano humano (SEMH)
Reator Volume (ml) Tempo de residência (h) pH R1: Estômago 200 2,5 2,0 R2: Intestino delgado 200 4 - R3: Cólon ascendente 500 20 5,6-5,9 R4: Cólon transverso 800 32 6,1-6,9 R5: Cólon descendente 600 24 6,6-6,9
Fonte: POSSEMIERS et al. (2004)
O protocolo experimental utilizando este tipo de reator foi previamente descrito por Van de Wiele et al., (2007) e inclui três períodos: período controle; período de tratamento e período pós- tratamento. O período controle de duas semanas (após a inoculação da amostra de fezes) permitiu a adaptação das bactérias intestinais às condições ambientais presentes nos diferentes compartimentos do cólon e a formação de uma comunidade microbiana estável. Durante este período, o meio alimentar basal (Tabela 4) passou pelo sistema três vezes ao dia, possibilitando a adaptação da comunidade microbiana às condições físico-químicas e nutricionais que predominam nas diferentes partes do cólon (MOLLY; WOESTYNE; VERSTRAETE, 1993). Após as duas semanas de adaptação foi iniciado o Período de Tratamento, onde o embutido cárneo probiótico, selecionado na etapa anterior, passou pelo sistema duas vezes ao dia, juntamente com o alimento basal, durante quatro semanas. O Período de Tratamento foi sucedido pelo Período de Pós-tratamento, com duração de duas semanas, em que somente o meio basal entrou no sistema.
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Figura 3. Representação dos reatores do simulador do ecossistema microbiano humano.
Controle de pH
1, alimento basal; 2, suco pancreático; 3, Reator 1 (estômago); 4, Reator 2 (duodeno); 5, Reator 3 (Cólon ascendente); 6, Reator 4 (Cólon transverso); 7, Reator 5 (Cólon descendente). As letras de a-g representam as bombas de transferência dos produtos entre os reatores. Controladores de pH nos reatores 3, 5, 6 e 7.
Tabela 4. Composição do meio alimentar basal dissolvido em água destilada. Constituintes Quantidades (g/L)
Amido 3,0
Pectina 2,0
Mucina (Suíno gástrica tipo III) 4,0
Xilana 1,0 Peptona 1,0 Triptona 1,0 Glicose 0,4 Extrato de levedura 3,0 L-cisteina 0,5
Fonte: PAYNE et al.(2003)