La reconnaissance ARNm::miRNA positionne et ancre le complexe RISC à sa cible et permet à ce dernier de contrôler la traduction et/ou la dégradation des ARNm. Chez les plantes, l’interaction des miRNAs à leurs cibles se fait de façon quasi-parfaite et induit un clivage endonucléolytique des ARNm (Jones-Rhoades et al., 2006). Néanmoins, de récentes évidences suggèrent que les miRNAs des plantes puissent également réguler la traduction (Brodersen et al., 2008; Lanet et al., 2009). Dans les cellules animales, la majorité des miRNAs se lient à leurs cibles de façon imparfaite pour réguler la traduction et/ou la dégradation exonucléolytique des ARNm (pour revue (Bartel, 2004; Bartel, 2009)). Dans de rares cas, les miRNAs de vertébrés interagissent de façon quasi-parfaite et induisent un clivage endonucléolytique (Davis et al., 2005; Seitz et al., 2003; Yekta et al., 2004). D’autres exemples de miRNAs (cités au § II-1-) pourraient agir de cette façon chez l’homme. Chez les mammifères, pour qu’un miRNA entraîne un clivage endonucléolytique sur un ARNm il faut qu’il soit associé à Ago2 car seule cette protéine, parmi la famille des protéines Ago, possède une activité de clivage endonucléolytique via son domaine « RNAse H-like » (Liu et al., 2004).
Des études expérimentales et bioinformatiques ont pu déterminer des règles d’appariement entre miRNA et ARNm dans les cellules animales :
(i) L’exigence la plus forte est une hybridation des nucléotides 2 à 8 (ou 2 à 7 : (Lewis et al., 2005)) en 5’ du miRNA, appelé la région 5’ d’ancrage (ou « seed region ») (Grimson et al., 2007) (figure 9). L’importance de cette région fut suspectée à l’origine pour l’interaction de lin-4 sur le 3’NTR de l’ARNm de lin-14, les auteurs ayant relevé un élément cœur en 5’ du miRNA s’hybridant sur le 3’NTR (Wightman et al., 1993). De plus, il a été observé chez la drosophile que les nucléotides 2 à 8 de plusieurs miRNAs sont capables de s’apparier à des éléments conservés de certains 3’NTR, éléments ayant été auparavant impliqués dans la répression post- transcriptionnelle de ces ARNm (Lai, 2002). Enfin, cette région 5’ d’ancrage des miRNAs est la portion la plus conservée des miRNAs homologues chez les métazoaires (Lewis et al., 2003; Lim et al., 2003b). Des études expérimentales ont
confirmé que la région 5’ du miRNA est essentielle puisque des substitutions de bases dans cette zone abolissent la répression des miRNAs sur la traduction de gènes rapporteurs (Brennecke et al., 2005; Doench and Sharp, 2004; Kloosterman et al., 2004). Par alignement de séquences sur cinq génomes différents, il a été observé que de nombreuses régions d’interaction de miRNAs ont un A en position 1 ainsi qu’un A/U en position 9 sur les ARNm cibles (même s’ils ne sont pas appariés avec le miRNA) (Lewis et al., 2005) (figure 9A).
Figure 9 ORF
[ ]
AAAA miRNA 1 8 13 16 région 5’ d’ancrage complémentarité 3’ 5’-P 3’-OH A[ ]
AAAA miRNA 5’-P 3’-OH B[ ]
1 8 13 16 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNA NNNNNNNN A U N Ago2 ARNmFigure 9 : interaction des miRNAs avec les ARNm dans les cellules animales.
(A) L’interaction des miRNAs se fait en général dans les 3’NTR des ARNm. La fixation du miRNA à sa cible doit être parfaite dans la région 5’ d’ancrage (entre les nucléotides 2-8 voire 2-7, matérialisé par des traits pleins entre les bases et entouré par le rectangle orange). De manière générale, il est observé un A en position 1 et un A ou U en position 9 dans l’ARNm par rapport au miRNA. Une boucle entre les nucléotides 9-12 est observée et empêche le clivage endonucléolytique de l’ARNm par Ago2. La région 3’ du miRNA doit être appariée au moins entre les bases 13 et 16 (matérialisé par le rectangle bleu). Les traits en pointillé indiquent d’éventuels appariements entre les bases. (B) Clivage endonucléolytique de l’ARNm. Si le miRNA présente un appariement élevé avec sa cible et que la région centrale (9-12) est appariée, Ago2 peut cliver l’ARN entre les bases 10-11 par rapport au 5’ du miRNA. N : nucléotides (A, T, C, G) ; ORF : open reading frame ; AAAA : queue polyA ; 5’-P : 5’-phosphate ; 3’-OH : 3’-hydroxyl. Adapté de (Filipowicz et al., 2008).
(ii) Le miRNA doit avoir également une certaine complémentarité en 3’, surtout entre les nucléotides 13 et 16 du miRNA (Grimson et al., 2007) (figure 9A). Cette région 3’ devient plus particulièrement importante quand l’appariement 5’ du miRNA est faible. En effet, un rôle compensatoire 3’ peut être observé pour des miRNAs dont la région 5’ contient un mésappariement ou un appariement de type wooble G::U (Brennecke et al., 2005; Vella et al., 2004). Il semble que les G::U puissent être délétères dans la région 5’ d’ancrage mais de nombreuses cibles de miRNAs validées expérimentalement montrent une tolérance pour les G::U (discuté par (Arteaga-Vazquez et al., 2006)).
(iii) De manière générale, les miRNAs possèdent une boucle ou des mésappariements
dans la région centrale (figure 9A). Pour qu’un miRNA (mais également un siRNA)
puisse induire un clivage endonucléolytique (entre les bases 10 et 11 par rapport au 5’ du petit ARN (Elbashir et al., 2001)), cette région ainsi que la région 5’ d’ancrage doit être appariée (figure 9B).
D’autres facteurs tels que l’accessibilité des miRNAs à leurs cibles (structuration des ARNm) sont des conditions importantes. En effet, plus la région d’interaction miRNA::ARNm est structurée, plus l’accessibilité du miRNA ainsi que sa répression diminuent. Des mutations ponctuelles dans la région 5’ d’ancrage d’un miRNA a un effet aussi délétère qu’une structure fermée en tige au niveau du site de reconnaissance (Kertesz et al., 2007). Il a été observé que des régions AU-riches, peu structurées en général, à proximité des sites d’interaction des miRNAs augmentent l’efficacité de répression d’un miRNA (Grimson et al., 2007).
Deux modes de reconnaissance des ARNm cibles des miRNAs ont été suggérés ; un balayage de l’ARNm cible par RISC via leur association aux ribosomes pour détecter une région d’interaction ARNm::miRNA ou un accès à la cible de façon aléatoire (Gu and Rossi, 2005). Cependant, il a été montré que l’action de clivage initié par un siRNA peut être découplé de la machinerie traductionnelle, excluant ainsi un balayage de RISC associé aux ribosomes (Gu and Rossi, 2005). De plus, dans les cellules animales il existe un biais important de la fixation des miRNAs aux 3’NTR des ARNm cibles (Gu et al., 2009), région non balayée par les ribosomes, favorisant ainsi la reconnaissance de la cible par « interaction aléatoire ARNm::miRNA ».
Un nombre important de bases de données prédisent les interactions miRNA::ARNm, la quasi-totalité se focalisant sur les régions 3’NTR probablement car une grande partie des régulations post-transcriptionnelles des ARNm impliquent ces dernières. Selon les bases de données plusieurs critères sont pris en compte tels que la robustesse de l’interaction de la région 5’ d’ancrage, le nombre de miRNAs sur le 3’NTR, les énergies de liaison, l’accessibilité à la cible, la conservation des interactions ARNm::miRNA entre espèces, le contexte de séquence (tableau 1).
Tableau 1 : outils bioinformatiques de prédiction des ARNm cibles des métazoaires.
Nom Critères (cf.
légende)
Lien internet Références
PicTar A, C, D, E http://pictar.mdc-berlin.de/ (Krek et al., 2005) TargetScan A, C, D, F, G,
H
http://www.targetscan.org/ (Friedman et al.,
2009) Miranda B, C, D, E http://www.microrna.org/microrna/home.do (Betel et al.,
2008) miRBase Utilise le logiciel Miranda http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/ (Griffiths-Jones et al., 2008) TarBase recensement d’ARNm cibles de miRNAs validés http://microrna.gr/tarbase (Papadopoulos et al., 2009)
RNA22 B, H, I http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html (Miranda et al., 2006)
RegRNA Utilise le logiciel Miranda, H
http://RegRNA.mbc.NCTU.edu.tw/ (Huang et al.,
2006) PITA A, B, D, F, H,
I
http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html (Kertesz et al., 2007)
A : robustesse de l’appariement de la région 5’ d’ancrage des miRNAs
B : robustesse plus ou moins importante l’appariement de la région 5’ d’ancrage des miRNAs C : nombre de miRNAs sur un 3’NTR (le même ou plusieurs miRNA(s))
D : conservation des régions cibles au sein de différentes espèces
E : combinaison d’expression des miRNAs pour apprécier une potentielle synergie sur une cible ; analyse des compétitions pour un même site d’interaction
F : contexte de séquence (AU-riche, distance par rapport au codon stop et à la queue polyA, 15 nucléotides après le codon stop), accessibilité de la région d’interaction
G : intègre un score pour des ARNm cibles contenant un A en position 1 et un A/U en position 9 sur l’ARNm
H : interrogation du logiciel de prédiction au cas par cas, non biaisée aux 3’NTR, possibilité de réaliser des prédictions sur n’importe quelle séquence d’ARN.
I : flexibilité de réglage des paramètres d’appariement miRNA::ARNm Ce tableau s’inspire de (Bartel, 2009)
Comme toute prédiction, ces données comportent des limites. Par exemple, la caractérisation (expérimentale, in silico) des 3’NTR peut être plus ou moins bonne. Si certaines bases de données tiennent compte des données d’expression des miRNAs dans certains tissus, l’expérimentateur doit s’assurer de la présence d’un miRNA et de sa cible in cellulo (Nakamoto et al., 2005). La base de données PicTar attribue un score pour les miRNAs en compétition d’interaction avec d’autres miRNAs, mais aucun logiciel ne prend en compte l’influence des RBP sur l’activité des miRNAs. (Krek et al., 2005). Même si les prédictions s’avèrent exactes, de nombreux exemples démontrent maintenant une dynamique de régulation des ARNm par les RBP et les miRNAs mais également l’influence des RBP sur l’activité et/ou le recrutement des miRNAs à leurs cibles. Par exemple la protéine HuR est capable de supprimer la répression du miR-122 sur l’ARNm de CAT-1 sous stress cellulaire (Bhattacharyya et al., 2006). Cette RBP est également capable de recruter let-7 sur le 3’NTR de c-Myc pour réduire l’expression de ce dernier (Kim et al., 2009a). Dnd1 est capable de contrecarrer l’action de certains miRNAs sur différents 3’NTR (Kedde et al., 2007).
Même si la majorité des régulations impliquant les miRNAs est observée au niveau des 3’NTR, des exemples montrent que les régions 5’NTR ou ORF sont également la cible de miRNAs. Par ailleurs certaines bases de données telles que RegRNA ou PITA fournissent des prédictions sur les interactions miRNA::ORFs, miRNAs::5’NTR (tableau 1). Il a ainsi été montré que let-7 est capable de réprimer la traduction d’un gène rapporteur en ciblant le 5’NTR ou le 3’NTR (Kloosterman et al., 2004; Lytle et al., 2007). Let-7 est également capable de réguler directement l’expression de Dicer en ciblant l’ORF de ce dernier (Forman et al., 2008). miR-148 est capable d’induire une diminution d’expression d’un des variants d’ARNm de DNMT3b en interagissant au niveau de l’ORF (Duursma et al., 2008). Une récente étude montre que la répression exercée par les miRNAs est possible dans l’ORF mais uniquement si l’élongation de la traduction par le ribosome est ralentie (Gu et al., 2009).