45
46 Numune Enjeksiyon Sistemi
Numune giriş sistemi ile çok az miktardaki numune kütle spektrometresine gönderilmektedir. Bu kısım vakum altındadır ve numune alma sırasında vakum’un azalmaması gerekmektedir. Bir mikromol (veya daha az) örnek gazlaştırılarak yavaş bir hızla 10-5 torr basınçtaki iyonizasyon odacığına gönderilir. (Cody, 2002; Anderson ve ark. 2007).
Numunenin cihaza alınması buharlaştırma, doğrudan veya kromatografi sisteminden olmak üzere üç şekilde yapılmakta (James, 2004).
Yüksek Vakum Sistemi
Kütle spektrometresi çalışmalarında sistemin vakum altına tutulması gerekmekte; Vakum, iki kademeli vakum sistemiyle sağlanır, Birincisi, bir rotary pompadır; bu kaba veya ön pompadır; 10-2 -10-4 torr vakum sağlar. İkinci pompa bir turbomoleküler veya bir difüzyon pompası olmakta.
Bu pompalar sayesinde vakum 10-5 torr değere ulaşbilmekte. Ancak yüksek vakum altında iyonlar, iyon kaynağından detektöre doğru hareket etme imkânı bulurlar.
Turbomoleküler pompada bir dizi bıçak veya kanat bulunur; bunlar 30.000-90.000 rpm hızla dönerken etrafta’ki gaz moleküllerini aşağı ve dışarı atarlar.İyi bir turbo pompa birkaç saat içinde temiz bir vakum ortamı sağlayabilir( Url 8, Anderson ve ark., 2007).
İyon Kaynagı
Moleküllerin iyonlaştığı bölümdür. Bir molekül, atom veya iyondan bir elektron uzaklaşması işlemine iyonizasyon denir. İyonlaştırma teknikleri; gaz, sıvı ve katı gibi maddenin farklı fiziksel durumuna ve maddenin ısısal kararlılığına bağlı olarak değişmekte.
İyonlaşma kaynaklarını başlıca gaz faz iyon kaynakları ve desorpsiyon iyon kaynakları olmak üzere iki grupta incelemek mümkündür.
47
Çizelge 2.6 .Kütle spektroskopide kullanılan iyon kaynakları (Skoog ve ark 1998)
Temel tip İyon kaynağı İyonlaştırıcı
Gaz fazı
Elektron impact (EI) Kimyasal iyonlaştırma (CI) Alan iyonlaştırma (FI)
Enerjik elektronlar Reaktif gaz iyonları
Yüksek potansiyelli elektrot
Desorpsiyon
Elektrosprey iyonlaştırma (ESI) Alan desorpsiyonu (FD) Matriks yardımlı desorpsiyon iyonlaştırma (MALDI) Plazma desorpsiyonu (PD) Hızlı atom bombardımanı (FAB) İkincil iyon kütle spektrometri (SIMS) Termosprey iyonlaştırma (TS)
Yüksek elektrik akımı Yüksek potansiyelli elektrot Lazer demeti
Cl’nin fusyon ürünleri Enerjik atom demeti Enerjik iyon demeti Yüksek sıcaklık
Gaz faz iyon kaynaklarında numune önce buharlaştırılır, sonra iyonize edilir.
Gaz faz kaynaklar genellikle kaynama noktası 500 ºC’nin altındaki ısıya dayanıklı numuneler için uygulanmakta. Gaz faz iyon kaynaklarından ‘’Electron impact’’ (EI) ve Kimyasal iyonlaştırma (CI) teknikleri en sık kullanılan tekniklerdir.
Moleküler iyon oluşumu M＋e－→M+＋2e－
Oluşan iyona yeni iyona fragmentör enerjisi verilerek alt iyonlar oluştururlur.
Desorpsiyon kaynaklarında ise numune likid veya katı halden direkt gaz iyonlara dönüştürülür. Isıya dayanıksız ve uçucu olmayan bileşiklere kolaylıkla uygulanmakta (Dougherty ve ark., 1981,Skoog ve ark., 1999) Desorpsiyon tipi iyon kaynaklarından;
FAB polar ve çok yüksek moleküler agırlıklı moleküllerin analizinde kullanılmaktadır (Donato ve ark., 1985). ‘’Electrospray’’ iyonizasyon (ESI) iyon kaynaklarının kullanımı oldukça yaygındır. Polipeptitlerin, proteinlerin ve oligo nükleotidlerin analizinde sıklıkla kullanılmaktadır (Mora ve ark., 2000).Matriks destekli desorpsiyon iyonizasyon (MALDİ) yeni bir iyonizasyon yöntemidir ve özellikle peptitlerin analizinde kullanılmaktadır (Kirpekar ve ark., 1998).LC-MS/MS’te en sık kullanılan iyonlaştırma teknikleri, ESI ve atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (APCI) teknikleridir. Bu tekniklerle iyonizasyon odasında negatif ya da pozitif iyonlaştırma gerçekleştirilir.
İyonizasyon sonucunda, genel olarak moleküler iyonlar (M+ veya M–), protonlanmış moleküller [M + H+, ], basit adduct iyonlar örn. [M + Na+], basit kayıplarla oluşmuş iyonlar örn. [M - H+] oluşmaktadır [Url 6].
48
ESI: Uçucu olmayan moleküllerin de gaz faz iyonlarının elde edilebilmesini sağlayan bir araçtır. HPLC veya benzer cihazdan gelen sıvı nebulizer sayesinde spreye dönüştürülür. Oluşan sprey elektriksel bir alandadır ve bu spreye 150-350 C sıcak gaz püskürtülür. Sprey içindeki 10 damlacık bu sayede kuruyarak küçülme eğilimindeyken Coulomb patlaması adı verilen fiziksel nedenle büyüme eğilimine girer. Bu iki kuvvet arasında kalan moleküller bir anda gaz faz iyona dönüşürler ve MS sisteminde analiz edilebilecek duruma dönüşürler. Bu sayede sıvı fazdaki maddeler MS ile analiz edilebilmektedir (Fenn, 1989; Gaskell, 1997).
Şekil 2.11.ESI şematik görünümü(Url 9)
Kütle Analizörü
İyon kaynağından çıkan iyonlaşma ürünleri analizöre gönderilir. Analizör, m/z oranlarına göre maddelerin ayrımının oldugu bölümdür. Günümüzde en çok kullanılan kütle analizörleri Quadrupole kütle analizörüdür (James, 2004).Quadrupole kütle spektrometresinde, 4 silindirik ya da hiperbolik çubuk elektrotlara bir radyo frekansı ve doğru akım alanının kombinasyonu uygulanır.
Uygulanan radyo frekans ve doğru akım voltajlarına göre Quadrupole çubukları ve iyon arasında elektriksel itme ve çekme etkileşimleri olur. İyon ters yüke sahip en
49
yakın quadrupole çubuğuna doğru hareket eder. Herhangi bir RF/DC potansiyel ayarında sadece belirli kütle/yük oranına sahip iyonlar, sabit salınım yaparak dedektöre ulaşırlar. Diğer iyonlar ise sabit olmayan yörüngeler izleyerek sistemde kaybolur.
Birbirine bakan 4 elektrodun merkezine en yakın noktada ilerlemesi istendiğinden, bu koşula en yakın voltajlar seçilir (Ardrey 2003).
Şekil 2.12.Quadropole (Url 10)
Dedektör
Kütle analizörlerinden çıkan iyonlar elektron çogaltıcı dedektöre ulasır. Elektron çogaltıcıda çarpışma sonucu oluşan akım önce analog voltaja, sonra da dijital sinyale dönüsür. Dedektörler sinyalleri 107degerine kadar arttırabilmekte. MS’den milisaniye aralıklarla gelen verilerin kaydedilmesi ve depolanması gereklidir. Bir bilgisayarla kolayca sağlanmaktadır (Brian, 2000).
2.21. Kütle Spektrometresi’nin Başlıca Uygulama Alanları 1-Tıp alanında ki analizlerde
Biyolojik çalışmalarda,
İlaç metabolizma, tanımlama, parçalanma ürünlerinde İlaç ruhsatlama çalışmlarında
2-Biyokimya analizlerinde
50 Protein ve peptid çalışmalarında
DNA çalışmalarında 3-Çevre Analizlerinde Gıdalardaki pestisitlerde
Toprak ve yeraltı sularındaki bulaşanlarda
4-Adli tıp ve klinik analizleri başlıca uygulama alanlarıdır (URL 5).
2.22. LC-MS/MS Cihazı ve Çalışma Prensibi
LC-MS/MS (high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry) tekniği ile yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde fizikokimyasal özelliklerine göre ayrılan moleküller kütle detektörü ile kantitatif analizler edilmektedir.
Analitlerin saflaştırılmış olarak MS/MS modülüne verilebilmesi için gerekli ayrımı sağlayan kromatografi tekniği ile kütle spektrometresinin teşhis kabiliyetinin birleşmiş olması, LC-MS/MS’i, oldukça farklı kütle spektrumuna sahip ancak benzer alıkonma karakterleri olan bileşikler için avantajlı hale getirmektedir. Bu özgüllüğü yüksek teknik ile kromatografi ile tek başına mümkün olmayan tayinlerde dahi başarı elde edilebilmektedir.
HPLC nin kütle spektrometrisi ile kombinasyonu, ayrımı tam gerçekleşmemiş analitler için dahi daha kesin bir teşhis ve kantitatif tayin imkanı sağlamaktadır.
Aynı kütle/iyon (m/z) oranına sahip pek çok molekülün mevcut olmasına karşın aynı parçalanma iyonlarına sahip molekül doğada 1/10000 dir. MS/MS tekniği analiz edilen maddeye özgü spesifik bir test olmasının yanısıra çok düşük derişimlerde maddenin miktar tayininin yapılabilmesini mümkün kılmaktadır (Anılanmert 2014) .
Seçiciliği ve hassasiyetinin gün geçtikçe artması, güvenilir bir yöntem olması, tek bir analiz ile birçok ilaç etken maddesinin aynı anda taranması, analiz süresinin kısa sürmesi, kalitatif ve kantitatif değerlendirmelerin oldukça kolay yapılabilmesi gibi bazı sebeplerden dolayı, LC-MS/MS’ler tercih edilmeyebaşlanmıştır.
LC-MS/MS çalışma prensibi; HPLC’ cihazından gelen sıvı nebulizer sayesinde spreye dönüşür. İyon kaynağı (ESI) sayesinde iyonlarına dönüşen maddeler kapiler boruda ilerler. Birinci kuadrupol filtrede (Q1) m/z (kütle/yük) oranına göre ayrılır.
Bunlara “parent” iyonlar denir. Tayin yapılacak iyon filtreden geçer, diğerleri kalır. Karekteristik “parent” iyonu böylelikle seçilir ve tanımlanır. Filtreden geçen iyon,
51
CID, çarpışma hücresi denilen (Q2) de yüksek saflıkta argon ya da azot gazı ile ikinci parçalanmaya uğrar. Q2, radyofrekanslı bir çarpışma odacığı olup, seçilen parent iyondan parçalanmış bir dizi farklı kütleli iyonlar elde edilir. Bunlara “doughter” iyon denir. Böylece ayrılmış olan “doughter” iyon ikinci MS analizöre gönderilir.
Q3 sadece ikinci iyonları filtre eder. Sadece bu ikincil iyonlar detektöre ulaşır ve bu iyondan hem nicel tayin, hem ’de nitel tayin gerçekleştirilir. Birincil parçalanmadan elde edilen parent iyonun ikinci kez parçalanması ve bu parçalanmadan elde edilen o analite özgü karakteristik iyonun izlenmesi işlemine MRM (Çoklu Reaksiyon İzleme) denir. Oluşan ikincil iyonların miktarı, MRM işleminin duyarlığını belirler.
Q3’ten detektöre gelen iyonlar elektron multiplier channel da dinodlarla çoğaltılır ve sinyal halinde okunur (Lehrer ve ark., 1996 ,Anılanmert 2014).
Şekil 2.13. QqQ (Triple Quadrupole)(Url 11)