I. BÖLÜM
4. OSMANLI HOŞGÖRÜSÜ VE MİDYAT
3.3. Kâtip ve Hademeler
4.1.1. Superfície e ceras
Nas fotomicrografias, observou-se que a superfície foliar da alface Vitória de Santo Antão apresentou características marcantes em sua micromorfologia (Figura 8). A superfície abaxial é constituída de células epiteliais irregulares, rugosas, com estômatos, porém, em menor quantidade que a superfície adaxial. O número de tricomas apresentou-se em quantidade muito menor na região abaxial. Estimou-se, para a superfície abaxial, a presença de um estômato para cada nove células epiteliais. Os estômatos concentraram-se em pequenas depressões, e a maioria não apresentou qualquer cobertura de cera. Sabe-se que a quantidade de estômatos presentes na superfície foliar pode ser influenciada pelas condições ambientais de crescimento das plantas como irrigação e insolação.
Pode haver uma relação entre quantidade de estômatos e quantidade de células de patógenos aderidas. Teoricamente, folhas de alface com um número maior de estômatos por unidade de área superficial podem aumentar as chances de entrada de células de E. coli O157:H7 (TAKEUCHI; FRANK, 2001).
A presença de ceras epicuticulares foi observada em ambas as faces da folha. A cera apresentou-se amorfa, como pequenos grânulos espalhados pela superfície ou depositados em depressões. Em alguns casos, as ceras cobriam completamente a abertura dos estômatos (Figura 8-B).
Figura 8 - Fotomicrografias da superfície foliar da alface Vitória de Santo Antão. A) Vista geral da superfície abaxial com células epiteliais, um estômato e ceras epicuticulares; B) Detalhe de um estômato recoberto de ceras; C) Detalhe da rugosidade da superfície e um tricoma; D) Detalhe da borda intacta natural da beirada da folha de alface. A e B são superfícies sanitizadas e C e D são superfícies somente lavadas.
Na maioria das espécies vegetais, a quantidade de ceras epicuticulares varia de 10 a 200 μg·cm-2, embora volumes acima de 300 μg·cm-2 foram informados (BAKER, 1982; MCWHORTER; OUZTS, 1993). A composição química das ceras epicuticulares é variável dentre os distintos grupos filogenéticos, com diferenças também dentro dos mesmos grupos e espécies ou em diferentes estádios de crescimento de um mesmo indivíduo. Os principais componentes químicos das ceras epicuticulares são n-alcanos, ésteres, alcoóis e ácidos graxos. A cera será mais hidrofóbica quanto mais apolar for seu constituinte químico (CHACHALIS; REDDY; ELMORE, 2001).
A composição química dessas ceras está relacionada com a morfologia de sua cristalização. Por exemplo, os hidrocarbonos e os alcoóis primários cristalizam-se na forma de placas. Os alcoóis secundários e as cetonas cristalizam na forma de túbulos, e os aldeídos na forma de grânulos. Quando as ceras são compostas por triterpenoides e acil ésteres, não há formação de cristais, sendo as suas estruturas, na sua maioria, amorfas (CHACHALIS, REDDY; ELMORE, 2001).
4.1.2. Adesão de Escherichia coli O157:H7 à superfície foliar da alface
A adesão de E. coli O157:H7 determinada pela contagem em placa indicou que o número de células aderidas nas bordas cortadas foi consideravelmente mais alto que o número de células aderidas na superfície central do cupom de alface (Tabela 2). No cupom, íntegro e com adesão, o número total de células aderidas foi estimado em 5,96 log UFC·cm-2de superfície. Porém, o número de células, somente nas bordas de 1 mm, foi 5,60 log UFC. Observou-se que a concentração de células foi maior do que o número de células aderidas à região central, estimadas em 4,21 log UFC.
Tabela 2 - Variação das contagens, médias (X) e desvios-padrão das médias (s) dos logaritmos
de células de Escherichia coli O157:H7 inoculadas e aderidas nas superfícies e nas beiradas cortadas nos cupons de alface Vitória de Santo Antão
Contaminação artificial com E. coli O157: H7 Faixa de
contagem
Adesão (log UFC) S
X
Total da adesão ao cupom (log UFC·cm-2) 5,98 - 5,93 5,96 ± (0,02) Adesão às beiradas cortadas (log UFC) 5,50 - 5,69 5,60 ± (0,09)
Adesão à parte central (log UFC) 3,84 - 4,50 4,21 ± (0,34)
Este número de células aderidas não caracteriza um biofilme bem estabelecido, mas, um processo de adesão. É o resultado entre as forças atrativas e repulsivas que regulam a interação entre a superfície foliar e o microrganismo. Por exemplo, a menor concentração de células observadas na superfície intacta pode ser associada com propriedades da superfície, como rugosidade e hidrofobicidade.
Nas fotomicrografias observou-se que as células de E. coli O157:H7 estavam aderidas às regiões abaxial e adaxial. Na literatura, há informações de que as bactérias encontram-se, naturalmente, em maior quantidade na parte inferior que na parte superior da folha. Isto ocorre em razão do maior número de estômatos e de tricomas, uma camada cuticular mais fina e, também, por causa da menor exposição à radiação ultravioleta nessa superfície (SOLOMON; BRANDL; MANDRELL, 2006).
Observou-se, também, que estômatos e tecidos danificados (Figura 9-A) serviram de entrada e abrigo para células do patógeno. Foram visualizados, tanto na alface inoculada quanto na naturalmente contaminada, vários estômatos colonizados por mais de uma bactéria (Figura 9-B). De acordo com Beattie e Lindow (1995), as bactérias penetram em estômatos e alojam-se em câmaras subestomáticas. A partir daí podem acessar o espaço intercelular abaixo do estômato. Para sobreviverem, alojam-se em estruturas com espaços interconectados e têm que adaptar-se a um vasto habitat que
tem alto potencial de oferecer condições para o crescimento, como água e nutrientes (SOLOMON; BRANDL; MANDRELL, 2006).
Figura 9 - Fotomicrografias dos sítios de adesão de Escherichia coli O157:H7 e da microbiota natural na superfície foliar da alface Vitória de Santo Antão. A) Células de Escherichia
coliO157:H7 colonizadas em estômatos e em lesões; B) Microbiota natural da alface
colonizada no estômato; C) Adesão de células de Escherichia coli O157:H7 ao longo da nervura; e D) Aglomerados de células de E. coli O157:H7, colonização de estômatos e adesão em dobraduras na superfície irregular.
Nesta pesquisa, sítios de adesão da bactéria E. coli O157:H7 na folha de alface incluíram cutículas, dobras naturais das cutículas, estômatos, tecidos danificados e nervuras (Figura 9-C). A explicação pode ser associada à abundância de nutrientes exsudados de fendas da camada cuticular. Bactérias são observadas em depressões, abaixo da cutícula e em estruturas específicas de uma planta em particular.
Outro fato observado é a adesão formando aglomerados de células (Figura 9-D). Há evidências de que a bactéria é circundada por uma camada de polissacarídeos extracelulares na superfície das folhas. Nas fotomicrografias eletrônicas de varredura, notou-se que exopolissacarídeos podem ancorar as células na superfície das folhas, o que previne o dessecamento e modifica o ambiente circundante para torná-lo mais favorável ao crescimento e à sobrevivência. A partir dessa matriz podem ser originados
os biofilmes, que podem concentrar nutrientes de fontes diluídas, fornecerem proteção de predadores e proteger as células de enzimas líticas e outros compostos inibitórios. A produção dessa matriz sobre as folhas pode ser altamente vantajosa para sobrevivência e crescimento (SOLOMON; BRANDL; MANDRELL, 2006).
Os fragmentos de 1 mm retirados das bordas dos cupons de 1cm x 1cm, foram observados pela MEV (Figura 10) e apresentaram altas concentrações de células aderidas com formação de aglomerados celulares que cobriram completamente as estruturas internas da folha (Figura 10-B). Assim, nesse experimento, E. coli O157:H7 aderiu preferencialmente nas bordas cortadas da alface Vitória de Santo Antão (Figura 10-C). Resultados semelhantes foram observados por Seo; Frank (1999), Takeuchi et al. (2000) e Takeuchi; Frank (2001), que constataram que E. coli O157:H7 aderiu preferencialmente na extremidade cortada da folha de alface.
Figura 10 - Fotomicrografias das bordas dos cortes de 1 mm de cupons das superfícies foliares de alface Vitória de Santo Antão aderidas com Escherichia coli O157:H7. A) Visão global; B) Visão lateral com células de Escherichia coli O157:H7 aderidas à superfície; C) Cobertura de células por toda extensão da borda cortada; e D) Borda cortada sem adesão.
bacteriana. Além disso, as cargas da superfície podem desempenhar importante papel na interação com superfícies sólidas. As cargas são influenciadas por grupamentos carboxílicos, amino, fosfato e sulfato do envelope celular e pela presença de fímbrias e flagelos (SHARMA; CHANG; YEN, 1985; LI; MCLANDSBOROUGH, 1999).
Hassan e Frank (2004) estudaram, além da produção de cápsula, a hidrofobicidade da superfície celular e cargas de células de E. coli O157:H7 cultivadas em caldo tripticase de soja (TSB) e caldo nutriente. Constataram que células cultivadas em TSB eram mais hidrofílicas que as cultivadas em caldo nutriente. Os autores constataram que as células cultivadas em meios diferentes apresentaram valores similares de potencial eletrocinético. Os resultados permitiram aos autores concluírem que as interações eletrostáticas não são responsáveis pelas diferenças na capacidade de adesão das células cultivadas nos diferentes meios. Portanto, a carga bacteriana foi atribuída aos constituintes da parede celular, incluindo grupamentos fosfatos, grupos carboxílicos e proteínas. A composição do meio de crescimento influenciou a hidrofobicidade e não a carga de superfície, o que indicou a falta de associação entre essas duas propriedades de superfície.
Nesse estudo, as células foram cultivadas em caldo nutriente e, portanto, seriam menos hidrofílicas. Porém, foi observado que as células estavam aderidas em maior concentração na superfície hidrofílica das bordas cortadas.
Há evidências de que bactérias produzem lectinas que podem mediar suas interações com carboidratos presentes nas superfícies das plantas. Sudakeviitz et al. (2004) caracterizaram duas lectinas em Ralstonia solanacearum que possuíam alta afinidade por açúcares presentes nas plantas. Uma dessas lectinas, denominada RS-IIL, é similar à lectina de Pseudomonas aeruginosa PA-IIL que contribui para agregação das células, especificidade pelo hospedeiro e virulência da bactéria.
Esta é outra possível explicação pela adesão preferencial de E. coli O157:H7 às bordas cortadas das folhas de alface. Esse fato pode ser associado com a interação das lectinas presentes na superfície celular da bactéria com carboidratos específicos que extravasaram dos tecidos danificados da folha de alface. Células agregadas foram observadas nas fotomicrografias.
A similaridade entre lectina presente em microrganismos patogênicos de vegetais e lectina de patógenos humanos é, portanto, mais um paralelo merecedor de atenção para auxiliar a decifrar os mecanismos de adesão de bactérias patogênicas humanas nas superfícies das hortaliças (SOLOMON; BRANDL; MANDRELL, 2006).
Abaixo da camada hidrofóbica coberta pelas ceras há a cutícula, uma estrutura porosa, hidratada, que pode ser uma rota de penetração hidrofílica. Portanto, lesões superficiais rompem a proteção natural e expõe estruturas que proporcionam aos
microrganismos abrigo e fornecimento de água e de nutrientes (AXTELL; BEATTIE, 2002).
Brandl (2008) estudou o efeito de diferentes lesões superficiais nas folhas de alface no crescimento de E. coli O157:H7, tendo em vista a segurança alimentar. Observou-se que após 4 horas da inoculação, a população aumentou 4,0, 4,5 e 11 vezes nas folhas de alface que foram, respectivamente, danificadas mecanicamente, cortadas em grandes pedaços ou fatiadas. Durante o mesmo intervalo de tempo, a população de
E. coliO157:H7 aumentou apenas duas vezes nas folhas que estavam intactas após a
colheita. O autor concluiu que o manuseio é fator que deve ser considerado para o desenvolvimento das atuais boas práticas agrícolas e protocolos de planos APPCC, considerando-se que os numerosos surtos de infecções causados por essa bactéria estão ligados ao consumo de hortaliças folhosas minimamente processadas e à baixa dose infecciosa de E. coli O157:H7 para humanos. Há ainda oportunidade de E. coli O157:H7 multiplicar-se em nichos presentes na superfície foliar da alface no período pós- colheita e que o crescimento da população ocorre num prazo curto. Portanto, esses fatos devem ser considerados em estudos de avaliação de risco.