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3.3.1. PCR- Reação em Cadeia da Polimerase

Foram estudadas duas regiões do gene TSPY (Testis-specific Protein, Y-encoded)

controle da amplificação, para verificar a presença de DNA nas amostras de DNA, foi utilizado a β-globina que está presente em ambos os sexos localizados no cromossomo 11.

Foram realizadas três reações de amplificação para cada amostra: a) TSPY, com iniciadores forward 1 e reverse 1 e re-amplificação (nested) com os iniciadores forward 2 e reverse 2; b) DYS14, com iniciadores forward 1 e reverse 1 e re- amplificação (nested) com os iniciadores forward 2 e reverse 2 e c) β-globina, com os iniciadores β-globina forward e β-globina reverse.

As reações de amplificação utilizando a técnica da Nested PCR foram realizadas no equipamento termociclador com gradiente de temperatura da Applied Biosystems®, modelo Veriti 96 Well. A primeira reação foi constituída em um volume final de 15 µL, contendo: 1X de solução tampão (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glicerol); 1,5 mM de MgCl2; 1,25 mM de cada nucleotídeo

(dATP, dTTP, dCTP e dATP – Promega Corp.); 10 pmol de cada um dos iniciadores externos (Forward 1 e Reverse 1) (Tabela 4); 1U de Taq DNA Polimerase Platinum (Invitrogen®) e 30 ng DNA total. A segunda reação foi realizada em um volume final de 15 µL, contendo: 1X de solução tampão (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mMDTT, 50% glicerol); 2,5 mM de MgCl2; 2,0 mM de

cada nucleotídeo (dATP, dTTP, dCTP e dATP – Promega Corp.); 5,0 pmol de cada um dos iniciadores internos (Forward 2 e Reverse 2) (Tabela 4), 1U de Taq DNA Polimerase Platinum (Invitrogen®_{) e 1,0 µL do produto da PCR da primeira reação.}

Em todas as séries de reações foi incluído um controle negativo de amplificação contendo todos os reagentes e o DNA era substituído por água, além de um controle positivo de uma gestante de um feto de sexo masculino (amostra 02) e um controle negativo de uma gestante de um feto de sexo feminino (amostra 03). O programa do ciclo térmico iniciou-se com uma fase de desnaturação a 95ºC por 5 minutos, 30 ciclos de 95ºC por 45 segundos (desnaturação da fita do DNA), 57 a 62ºC por 45 segundos (anelamento dos iniciadores), 72ºC por 1 minuto (incorporação dos nucleotídeos) e seguido de uma extensão final a 72ºC por 10 minutos.

Os produtos gerados na PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose (USB UltraPure®) a 2%, preparada com tampão TAE 1X e 1 µL de GelRed – Biotium® em uma mini cuba horizontal (BioAgency®). No momento de aplicar no gel as amostras foram ressuspendidas em tampão Loading Buffer 6X e a corrida foi conduzida a uma tensão de 80 V por 30 minutos. O tampão utilizado para a corrida foi o mesmo utilizado no preparo do gel.

Após a corrida o gel foi visualizado em transiluminador de U.V. (UVP- BioResearch®) e os resultados registrados em um sistema de fotodocumentação e analisados pelo software (Doc-It 3.0®).

Foram consideradas positivas para o sexo masculino as amostras que apresentaram fragmentos de tamanho de 250 pb correspondentes à região TSPY e 198 pb correspondentes à região DYS14.

As amplificações que não apresentavam os fragmentos correspondentes para a região TSPY e DYS14, mas que apresentavam a amplificação do fragmento de 620 pb que corresponde à sequência do gene β-globina eram consideradas do sexo feminino.

Tabela 4: Sequências dos iniciadores para amplificação por PCR dos genes TSPY, DYS14 e β-Globina

Gene Nome Sequências dos iniciadores

(5'-3') Tm (°C) Tamanho (pb) TSPY

TSPY Forward 1 5' GTG GAA GAA GAG AAG CAT CC 3' 56

350

TSPY Reverse 1 5' GAG TGG AAT GAG AAG CCC TG 3' 59

TSPY Forward 2 5' CTG ACG AAG ATG AAG ACT TGC 3' 57

250

TSPY Reverse 2 5' AGT CCC CTG ACG TCT CTG TT 3' 59

DYS-14

DYS-14 Forward 1 5' CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT 3' 58

240

DYS-14 Reverse 1 5' TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG 3' 61

DYS-14 Forward 2 5' CAT CCA GAG CGT CCC TGG CTT 3' 59

198

DYS-14 Reverse 2 5' CTT TCC ACA GCC ACA TTT GTC 3' 56 β-Globina β-

Globina Forward _{5' CCT GAG AGC TTG CTA GTG ATT 3' 54}

620 β-Globina Reverse _{5' TAG TCC CAC TGT GGA CTA CTT 3' 54}

3.3.2. LAMP- Loop mediated isothermal amplification

Para esta metodologia de amplificação foram estudadas as mesmas regiões da PCR: a região do gene TSPY (Testis-specific Protein, Y-encoded) e um pseudo

gene desta região, o DYS14, localizado no cromossomo Y. O projeto dos iniciadores foi realizado utilizando-se o software Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/) e seguindo o protocolo padrão fornecido pela empresa que desenvolveu a técnica de LAMP.

As reações de amplificação foram realizadas em banho seco (Labmet® - Digital Dry Bath) e em termociclador com gradiente de temperatura da Applied Biosystems, modelo Veriti 96 Well. A reação foi constituída em um volume final de 25 µL, contendo: 1X de solução tampão (20 mM Tris-HCl, pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 1,6 mM de cada nucleotídeo

(dATP, dTTP, dCTP e dATP – Promega Corp.), 25 pmol de cada um dos iniciadores internos (FIP e BIP), 5 pmol de cada um dos iniciadores externos (B3 e F3) (Tabela 5), 1M de Betaína (Sigma), 8U de Bst DNA polymerase large fragment

(New England Biolabs) e 30ng de DNA.

Em todas as séries de reações foi incluído um controle negativo de amplificação contendo todos os reagentes e o DNA era substituído por água, além de um controle positivo de uma gestante de um feto de sexo masculino (amostra 02) e um controle negativo de uma gestante de um feto de sexo feminino (amostra 03). As amostras depois de preparadas foram incubadas variando a temperatura de 60 a 65ºC e o tempo de 30 a 90 minutos.

Os produtos gerados no LAMP foram submetidos à eletroforese em gel de agarose (USB UltraPure®_{) a 2%, preparados com tampão TAE 1X e 1 µL de}

GelRed – Biotium® em uma mini cuba horizontal (BioAgency®_{). No momento de}

aplicação no gel as amostras foram ressuspendidas em tampão Loading Buffer 6X e a corrida foi conduzida a uma tensão de 80 V por 30 minutos. O tampão utilizado para a corrida foi o mesmo utilizado no preparo do gel.

Após a corrida, o gel foi visualizado em transiluminador de U.V. (UVP- BioResearch®) e os resultados registrados em um sistema de foto-documentação e analisados no software Doc-It 3.0®.

Foram consideradas positivas para o sexo masculino as amostras que apresentaram o padrão de bandas específicas do LAMP. As amplificações que não apresentavam amplificação eram consideradas do sexo feminino.

Tabela 5: Sequências dos iniciadores para amplificação por LAMP dos genes TSPY e DYS14

Gene Nome Sequências dos iniciadores (5'-3')

TSPY

FIP_TSPY 5' GAG GGA CGC TCT GGA CGT TTT GGC AGC GGG AAA AGA TGG 3' BIP_TSPY 5' TGC AAA CCA CCC CCA GAT GTT TTT CCA TGT AGC TCA GCA TGT CT 3' F3_ TSPY 5' GTT AAT GCC CAA GCC AGG AA 3'

B3_TSPY 5' GCT TCT CTT CTT CCA CCT CC 3'

DYS14

FIP_DYS14 5' GCA ACT CCC CTT TGT TCC CCA ATT TTT CGG GGA AGT GTA AGT GAC C 3' BIP_DYS14 5' CTA TTG TCC TGC ATG CGG CAG ATT TTA AGA TGC CCC AAA CGT CTG 3' F3_DYS14 5' GGCCTTTCTAGTAGTGGAGAGGT 3'