3. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA
3.6. Isısal Kararlılık
Isısal kararlılık deneyleri, çeşitli sıcaklıklarda substrat yokluğunda inkübe edilen serbest ve tutuklu enzimler ile gerçekleştirildi. Şekil 3.7’de serbest ve immobilize invertaz için 60 ve 70 oC arasındaki ısı inaktivasyon grafikleri gösterildi. Tutuklu invertaz 60oC’de başlangıç aktivitesinin tamamını korurken serbest enzim 120 dakika inkübasyondan sonra başlangıç aktivitesinin %11’ini koruduğu belirlendi. Serbest ve tutuklu enzimler 70oC’de sırasıyla 30 ve 90 dakika işlemden sonra başlangıç aktivitelerini kaybettiler. Yarı ömür değerleri ve ısısal inaktivasyon hız sabitleri, serbest ve tutuklu enzim için iki farklı sıcaklıkta, yüzde kalan aktiviteden tayin edildi ve sonuçlar invertaz enziminin magnetik poli(GMA-ko-MMA) mikrokürelerine immobilizasyonu ile ısısal kararlılığının büyük ölçüde arttığını gösterdi. Serbest invertaz için gözlenen hızlı inaktivasyonun, invertazın konformasyonel yapısının bozunmasından kaynaklandığı düşünüldü(20). Serbest enzim 70 oC’de 30 dakika içinde hızla denatüre olurken, tutuklu enzim de gözlenen serbest enzime kıyasla daha yavaş denatürasyonun, invertazın magnetik kürelere çok noktadan
bağlandığını ve immobilize enzimin konformasyonel yapının kararlı kaldığının bir göstergesi olarak değerlendirildi(32). Yukarıdaki verilen bilgiler ışığında, bu çalışmada kullanılan tutuklama yöntemi sonucu, invertaz enziminin ısısal kararlılığının belirgin bir artış sağlandığı doğrultusundadır. Özellikle kovalent bağlı sistemlerde, sıcaklık ve denatüre edici ajanlara karşı tutuklu enzimin aktivite kaybı serbest formuna kıyasla daha fazladır.
Şekil 3.7. Serbest ve immobilize invertaz enziminin kararlılığına sıcaklığın etkisi
3.7. Depolama Kararlılığı
Genel olarak, eğer enzim çözeltide bulunuyorsa, depolama sırasında kararlı değildir ve enzim aktivitesinin kademeli olarak azaldığı araştırıcılar tarafından rapor edilmiştir. Serbest ve tutuklu invertaz preparasyonları, ıslak ve kuru formda saklanabilir. İmmobilize enzimin depolama kararlılığı, özellikle sürekli sistem uygulamaları için önemlidir.
0 20 40 60 80 100
0 30 60 90 120 150
Zaman (dak)
İnvertaz aktivitesi (%) Serbest invertaz (60oC) immobilize invertaz (60 oC) Serbest invertaz (70oC) immobilize invertaz (70 oC)
Asetat tamponu (50 mM, pH =5.0) içindeki serbest ve tutuklu invertazın depolama kararlılığı Şekil 3.8’de gösterildi. Şekilden görüldüğü gibi, tutuklama işlemi enzimin depolama kararlılığını arttırdı, serbest enzim 29 gün içerisinde tüm aktivitesini kaybetti. Bunun yanında, tutuklu enzim aynı depolama periyodu süresince aktivitesinin %14’ünü kaybettiği gözlendi.
Bu sonuç, tutuklu invertazın serbest enzimden daha fazla bir depolama kararlılığı gelişimi sergilediğini gösterdi.
Şekil 3.8. Serbest ve immobilize invertaz enzim eşleniklerinin depolama kararlılığı
4. SONUÇ
Enzim saflaştırılması işleminin yüksek maliyeti ve uygulamalarda bir defa kullanılması araştırmacıları alternatif çözümler bulmaya yönlendirmiştir.
Enzimlerin kararlılıklarının ve tekrar kullanım sayılarının artırılması ve buna bağlı olarak üretim maliyetinin düşürülmesi, yüksek sıcaklık uygulamalarına dayanıklılıklarının artırılabilmesi amacı ile farklı immobilizasyon teknikleri
0 20 40 60 80 100
0 10 20 30 40 50 60
Zaman (gün)
İnvertaz aktivitesi (%)
Serbest invertaz immobilize invertaz
kullanılarak enzimlerin katı destek materyallerine kimyasal ve fiziksel yollarla immobilize edilebilmesi bu çalışmaların bir sonucu olarak ortaya çıkmıştır.
Bu çalışmada, enzim immobilizasyonu teknikleri arasında yer alan kovalent bağlanma yöntemi ile invertaz enzimi magnetik kürelere tutuklandı. Bu doğruluda, küre yapıda manyetik destek malzemeleri geliştirildi. Sunulan tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen deneysel çalışmalar; i) Isısal çöktürme reaksiyonu sırasında, manyetik kürelerin epoksi grupları, ortamda mevcut olan amonyak varlığında amonolizis reaksiyonu sonucu kürelerin yüzeyinde, amino gruplarının oluşturulması sağlandı; ii) magnetik mikrokürelerin amino gruplarının aktivasyonu glutaraldehit kullanılarak sağlandı ve bu yolla invertaz enzimi manyetik kürelerin yüzeyine kovalent olarak immobilize edildi; iii) tez çalışması magnetik poli(GMA-ko-MMA) mikrokürelerin karakterizasyonu, ve iv) serbest ve immobilize invertaz eşleniklerinin aktivitelerinin tayini, enzimin katalitik özelliğinin belirlenmesi, ısısal ve işlemsel kararlılığına farklı parametrelerin etkisinin araştırılması yapılarak tamamlandı. Magnetik ayırma teknikleri, zor koşullu ayırma basamaklarını elimine ederek kısa işlem süresi ve ekonomik işletim maliyeti getirmesi ve otomasyona ve sürekli sistemlere kolaylıkla adapte edilmeleri nedeni ile diğer klasik enzim tutuklama tekniklerine kıyasla önemli üstünlükler sağlamaktadır.
Sunulan çalışmanın başlıca avantajları arasında; i) enzim tutuklanması için ön-aktivasyon basamağına ihtiyaç duyulmaması; ii) epoksi grubu yoğunluğu, gözenekliliğin ve boy ve boyut dağılımının istenildiği gibi kolayca ayarlanabilmesi; iii) daha önce bildirilen destek
materyallerine kıyasla daha yüksek tutuklama kapasitesine sahip olması;
iv) enzim elektrodu yada enzim reaktörünün bir parçası gibi çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için iyi bir mekanik kararlılığa sahip olması olarak sıralanılabilir. Daha önce bahsedildiği gibi, tutuklu enzimin optimum pH ve sıcaklık profili serbest formuna kıyasla farklılık göstermiştir ve enzimin ısısal kararlılığı tutuklama sonucunda artmıştır.
Araştırmanın sonucunda elde edilen enzim tutuklu magnetik mikroküreler destek materyali olarak çok sayıda olumlu özelliklere sahip olduğu görüldü ve kovalent olarak invertaz enziminin tutuklanmasında kullanıldı.
KAYNAKLAR
1. Diekmann R., Hempel D. C., Immobilization techniques, bioreactors and improvements in downstream processing, Ann.
of the Sci., 10, 245-255, 1990.
2. Sheper T., Advances in Biochem. Eng./Biotech., Springer-Verlag, Berlin, Germany
3. Emerson D., Peteu S.F., Worden R.M., A catalase microbiosensor for detecting hydrogen peroxide, Biosen.
Bioelectron, 10, 673-678, 1996.
4. Scheller F., Karsten C., A combination of invertase reactor and glucose oxidase electrode for the successive determination of glucose and sucrose, Anal. Chim. Acta, 155, 29-36, 1983.
5. Gouda D., Thakur M. S., Karanth N. G., Optimization of the multienzyme system for sucrose biosensor by response surface methodology, Electroanal., 17,18-849, 2001.
6. Hearn E., Neufeld R. J., Poly(methylene co-guanidine) coated alginate as an encapsulation matrix for urease, Process Biochem., 35, 1253-1260, 2000.
7. Wiseman A. (Editor), Handbook of Enzyme Biotechnology, TJ Pres Ltd., Cornwall, UK, 465-466, 1995.
8. Boy M., Dominik A., Vos H., Fast determination of biocatalyst process stability, Process Biochem., 34, 535-547, 1999.
9. Arıca M. Y., Epoxy-derived pHEMA membrane for use bioactive macromolecules immobilization, Jour. Appl. Polym. Sci., 77, 2000-2008, 2000.
10. Krizova J., Spanova A., Rittich B., Horak D., Magnetic hydrophilic methacrylate-based polymer microspheres for genomic DNA isolation, Jour. of Chromatog. A,1064, 247-253, 2005.
11. Bayramoğlu G., Loğoğlu E., Arıca M. Y., Cytochrome c adsorption on glutamic acid ligand immobilized magnetic
poly(methylmethacrylate-co-glycidylmethacrylate) beads, Colloids and Surfaces A: Physicochem. and Eng. Aspect, Article in press
12. Bayramoğlu G., Arıca M. Y., Kinetics of mercury ions removal from synthetic aqueous solutions using by novel magnetic p(GMA-MMA-EGDMA), Jour. Hazard. Material., 2007, in press 13. Melo J.S., D’Souza F.D., A simple approach for the
simultaneous isolation and immobilization of invertse using crude extracts of yeast and Jack Bean meal, Jour. of Biochem.
and Biophys. Meth., 42,133-135, 2000.
14. Combess D., Monsan P., Influence of additives on the thermostability of glucose oxidase, Enz. and Microb. Technol., 10, 498-502, 1988.
15. Schulz B., Riedel A., Abel P.U., Influence of polymerization parameters and entrapment in poly (hydroxyethyl methacrylate) on activity and stability of GOD, Jour. of Molec. Catal. B:
Enzymatic, 7, 85-91,1999.
16. Bayramoğlu G., Yılmaz M., Arıca M. Y., Immobilization of a thermostable amylase onto reactive membranes kinetics characterization and application to continuous starch hydrolysis, Food Chem., 84, 591-599, 2004.
17. Worsfold P. J., Classification and chemical characteristics of immobilized enzymes (Technical reports) Pure and Appl.
Chem., 67, 597-600, 1995.
18. Ahmad S., Anwar A., Saleemuddin M., Immobilization and stabilization of invertase on Cajanas cajan lectin support, Biores. Technol., 79, 121-127, 2001.
19. Braun B., Klein E.& Lopez, J.L., Immobilization of Candida rugosa Invertase to Nylon Fiber Using Its Carbonhydrate Groups as The Chemical Link, Biotechnology & Bioengineering, 51, 327-341, 1996.
20. Choi S-H., Wu W-T., Immobilization of Candida rugosa invertase on Chitosan with activation of the hydroxyl groups, Biomaterials, 25, 197-204, 2004.
21. Edwards W., Leukes W. D., Rose P.D., Burtan S. G., Immobilization of polyphenol oxidase on chitosan-coated polysulphone capillary membranes for improved phenotic effluent Bioremediation, Enzy. and Microb. Technol. , 25,769-773, 1999.
22. Corma A., Farnes V., Jorda J. L., Rey F.,Fernandez,Lafuente R., Guisan J.M., Mateo C., Electrostatic and covalent immobilization of enzymes on ITQ-6 delaminated zeolitic materials, Biotechnol. Bioengineering,68, 419-420, 2000.
23. Arıca M.Y., Bayramoğlu G., Invertase reversibly immobilized onto polyethylemine-grafted poly(GMA-MMA) beads for sucrose hydrolysis, Jour. of Molec. Catal. B: Enzymatic, 38, 131-138, 2006.
24. Arıca M.Y., Senel S., Alaeddinoğlu N.G., Patır S., Denizli A., Invertase immobilized on spacer-arm attached
poly(hydroxyethyl methacrylate) membrane: Prepartion and properties, Jour. of Appl. Poly. Sci., 75, 1685-1692, 2000.
25. Sidney S., Quantitative Organic Anal., 3. Baskı, 1967.
26. Bayramoğlu G.,Tunalı Y., Arıca M. Y., Immobilization of β- galactosidase onto magnetic poly (GMA-MMA) beads for hydrolysis of lactose in bed reactor, Catal. Commun., Article in press.
27. Lochmuller C.H., Ronsicle C.S.,Wigman L.S., Fluidized-bed separators rewiewed: A Low pressure drop approach to column chromatography, Prep. Chroma., 1, 93-108, 1988.
28. Burns M.A., Graves D.J., Continuous affinity chromatography using a magnetically stabilized fluidized bed, Biotechnol. Prog.
1, 95-103, 1985.
29. Bayramoğlu G., Akgöl S., Bulut A., Denizli A., Arıca M. Y., Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate: Properties and application in a continuous flow system, Biochem. Eng. Jour., 14, 117-126, 2003.
30. Wada S., Ichikawa H., Tatsumi K., Removal of phenols and aromatic amines from wastewater by a combination treatment with tyrosinase and a coagulant, Biotechnology and Bioengineering, 45, 304-309, 1995.
31. Pieters B. R., Bardeletti G., Coulet P. R., Glucoamylase immobilization on a magnetic microparticle for the continuous
hydrolysis of maltodextrin in a fluized bed reactor, Appl.
Biochemical and Biotechnology, 32, 37-53, 1992.
32. Bahar T., Çelebi S.S., Characterization of Glucoamylase Immobilized on Magnetic Poly (styrene), Enz. and Microb.
Technol., 23, 301-304, 1998.
33. Arıca M.Y.,Alaeddinoğlu N.G., Hasırcı V., Immobilization of glucoamylase onto activeted PHEMA/EGDMA microspheres:
Properties and Application to a packed-bed reactor, Enz. and Microb. Technol., 22, 152-157, 1998.
34. Boyer P.D. (Editor), The Enzymes, Academic Pres. USA, 5, 1971.
35. Sahmetlioğlu E., Yörük H. Toppare L., Ciango I., Yağcı Y., Immobilization of invertase and glucose oxidase in conducting copolymers of thiophene functionalized poly(vinyl alcohol) with pyrrole, Reac. and Func. Polym., 66, 365-371, 2006.
36. David A.E., Wang N.S., Yang V.C., Yang A.J., Chemically surface modified gel (CSMG);An excellent enzyme-immobilization matrix for industrial processes, Jour. of Biotechol.,35,2095-2098,2006.
37. Cirpan A., Alkan S., Toppare L., Hepuzer Y., Yağcı Y., Immobilization of invertase in conducting copolymers of 3-methylthienyl methacrylate, Bioelectrochem., 59, 29-33, 2003.
38. Chen Y., Kang E.T., Neoh K.G., Tan K.L., Covalent immobilization of invertase onto the surface- modified
polyaniline from graft copolymerization with acrylic acid, Europ.
Polym. Jour., 36, 2095-2103, 2000.
39. Tümtürk H., Arslan F., Dişli A., Tufan Y., Immobilization of invertase attached to a granuler dimer acid-co-alkyl polyamine, Food Chem., 69,5-9, 2000.
40. Arslan F., Tümtürk H., Çaykara T., Şen M., Güven O., The Effect of gel composition on the adsorption of invertase on poly (acrylamide/maleic acid) hydrogels, Food Chem., 70, 33-38, 2000.
41. Soares C.M.F., de Castro H.F., de Mareas F.F., Zanin G.M., Characterisation and utilisation of Candida rugosa invertase immobilized on controlled pore Silica, Appl. in Biochem. and Biotechnol., 77, 745-751, 2000.
42. Bagal D., Karve M.S., Entrapment of plant invertase within novel composit of agarose-guar gum biopolymer membrane, Anal. Chim. Acta, 555, 316-321, 2006.
43. Amaya-Delgado L., Hidalgo-Lara M.E., Montes-Horcasitas M.C., Hydrolysis of sucrose by invertase immobilized on nylon-6 microbeads, Food Chem., 99, 299-304, 2006.
44. Emregül E., Sungur S., Akbulut U., Polyacrilamide-gelatine carrier system used for invertase immobilization, Food Chem., 97, 591-597, 2006.
45. Gomez L., Hector L.R., Villalonga J.H., Villalonga R., Immobilization of chitosan-modified invertase on
alginate-coated chitin support via polyelectrolyte complex formation, Enz. and Microb. Technol., 38, 22-27, 2006.
46. Bora U., Kanan K., Nahar P., A simple method for functinonalization of cellulose membrane for covalent immobilization of biomolecules, Jour. of Memb. Sci., 250, 215-222, 2005.
47. Gürsel A., Aklan S., Toppare L., Yağcı Y., Immobilization of invertase and glucose oxidase in conducting H-type polysiloxane/ polypyrrole black copolymers, React. and Func.
Polym., 57, 57-65, 2003.
48. Işık S., Aklan S., Toppare L., Ciango I., Yağcı Y., Immobilization of invertase and glucose oxidase in poly 2-methylbutyl-2-(3-thienyl) acetate/polypyrrole matrices, Europ. Polym. Jour., 39, 2357-2381, 2003.
49. Prodanovic R.M., Simic M.B., Vojcic Z.M., Immobilization of periodate oxidized invertase by adsorption on sepiolite, Jour.
Serb. Soc., 68, 819-824, 2003.
50. De Querioz A., Vitolo M., de Oliveira R.C., Zazuco H.O., Invertase immobilization onto radiation-induced graft copolymerized polyethylene pellets, Radiat. Phys. Chem., 47, 873-880, 1996.
51. Vrabel P., Polakovic M., Godo S., Bales V., Gemeiner P., Influence of immobilization on the thermal inactivation of yeast invertase, Enz. and Microb. Technol., 21, 196-202, 1997.