İTİRAZA ÖZGÜ SORUNLAR 1. İtiraz Geri Alınabilir mi?

Na tentativa de melhorar a resolução do experimento, em seguida, com a corrida otimizada pelo HIPAC-B foi inserido provenientes deste no Módulo HIPAC-S na tentativa de melhorarmos a resolução do experimento.

A corrida sugerida foi: 54% de B (MeOH) em 150 minutos a 1,5 mL/min, coluna 55 cm, C8 (Figura 135) e que apresentou excelente correlação linear com os dados sugeridos

pelo programa: 1,00.

Predição 17

Figura 136. Simulação com HIPAC-S usando as seguintes condições: 150 x 4,6mm, 5 m C8;; modo isocrático com 54 % de B em 50 minutos e fluxo de 1,5 mL/min.

Minutes 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 m AU 0 50 100 0 50 100

Predição 17.1 RT (observado) RT (Simulado) Δ t t Hesperidina 2,06 2,07 0,01 2,065 0,4842615 SAS1336 1,749 1,76 0,011 1,7545 0,62695925 Quercetina 4,225 4,26 0,035 4,2425 0,82498527 Kanferol 4,844 4,88 0,036 4,862 0,74043603 Tilirosídeo 4,86 4,93 0,07 4,895 1,43003064 SPEA - 01 16,254 16,54 0,286 16,397 1,7442215 SPEA –1Me 28,954 29,5 0,546 29,227 1,86813563 SPEH - 01 42,83 43,64 0,81 43,235 1,87348213

Predição 17.2 _(observado) RT _{(Simulado) Δ t} RT t Δ% Hesperidina 2,047 2,07 0,023 2,0585 1,11732 SAS1336 1,739 1,76 0,021 1,7495 1,20034 Quercetina 4,151 4,26 0,109 4,2055 2,59184 Kanferol 4,732 4,88 0,148 4,806 3,07948 Tilirosídeo 4,745 4,93 0,185 4,8375 3,82429 SPEA - 01 15,909 16,54 0,631 16,2245 3,88918 SPEA –1Me 28,344 29,5 1,156 28,922 3,99696 SPEH - 01 41,96 43,64 1,68 42,8 3,92523

Figura 138. Dados cromatográficos e seus respectivos gráficos de correlação entre o previsto pelo HIPAC e o obtido de forma real no aparelho de CLAE-DAD (Corrida otimizada sugerida em modo isocratico a 54%B em 70 minutos). Predição 17.

Predição 17.3 _(observado) RT _{(Simulado) Δ t}RT t Δ% Hesperidina 2,062 2,07 0,008 2,066 0,38722 SAS1336 1,751 1,76 0,009 1,7555 0,51267 Quercetina 4,216 4,26 0,044 4,238 1,03823 Kanferol 4,826 4,88 0,054 4,853 1,11271 Tilirosídeo 4,835 4,93 0,095 4,8825 1,94572 SPEA - 01 16,285 16,54 0,255 16,4125 1,55369 SPEA –1Me 29,003 29,5 0,497 29,2515 1,69906 SPEH - 01 42,908 43,64 0,732 43,274 1,69155 y = 1,0199x - 0,0372 R2 _{= 1} 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 10 20 30 40 50

Oti. Hipac -S Isso. 54% B a 1,5ml/min. 1.2

y = 1,0416x - 0,0445 R2 = 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 10 20 30 40 50

Oti. Hipac -S Isso. 54% B a 1,5ml/min. 1.3

y = 1,0176x - 0,0214 R2 = 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 10 20 30 40 50

Predição 17 RT (observado) _{(DP) (EPM)} SAS 1336 2,06 0,01 0,40 Hesperidina 1,75 0,01 0,37 Kanferol 4,20 0,04 0,96 Tilirosideo 4,80 0,06 1,25 Quercetina 4,81 0,06 1,26 SPEA - 01 16,15 0,21 1,29 SPEA-1Me 28,77 0,37 1,28 SPEH - 01 42,57 0,53 1,24

Figura 139 Resultados sumarizados dos dados obtidos em triplicata com os desvios padrões e erros padrões da média referentes aos dados obtidos no experimento em CLAE-DAD a partir da otimização Oti. HIPAC -S Isso. 54%B a 1,5ml/min

y = 1,0262x - 0,0343 R2 _{= 1} 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00

dados preditos e os dados experimentais (Figura 137), comprovado pelo coeficiente de correlação (r2_{) de 1. O desvio padrão médio (Figura 138) destes valores varia de 0,01 min a}

0,53 min. O modulo HIPAC-S não nos fornece mapa de resolução, mapa de resposta ou mapas de retenção como os módulos HIPAC-G e HIPAC-B.

quanto pela precisão e confiabilidade de seus resultados (KEVIN ROBARDS; HADDAD, 1994; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997). Entretanto possui certa complexidade na escolha de parâmetros que regem a separação, tornando a tarefa exaustiva, com grande gasto de tempo e recursos (GLAJCH, 1989; DOLAN, 1992; HITCHEN, 1994a; KEVIN ROBARDS; HADDAD, 1994; ALTENHOENER, 1997; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997). Para poupa-los e promover o uso racional do equipamento de análise os desenvolvedores criaram softwares baseados em modelos matemáticos para simular em computadores e microprocessadores as particularidades envolvidas nas separações realizadas em CLAE (D'AGOSTINO, 1985; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997).

Antigamente os cálculos das simulações duravam horas, necessitavam de muitos dados experimentais e tinham limitado espectro de aplicação nos variados modos de técnicas na CLAE; , modo isocratico, modo gradiente, solventes ternários e quaternários (COTTON, 1983; D'AGOSTINO, 1985). Hoje em dia com melhor tecnologia computacional e design de softwares mais arrojados pode-se desenvolver métodos com cálculos de simulação que duram alguns segundos, cobrindo várias modalidades de experimentos em CLAE (SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH , 1997; HANAI, 2004; WICK, 2004; LIPKOWITZ, 2007).

Programas como Drylab (LC Resources, Walnut Creek, Califórnia) possuem ampla gama de trabalhos publicados relatando sua aplicação e confiabilidade (JUPILLE, 1988; MARKOWSKI, 1990; DOLAN, 1992; LEWIS, 1992a; LEWIS, 1992b; SNYDER, KIRKLAND, GLAJCH, 1997; DOLAN, 1998). No mercado pode se encontrar outros softwares como o PREOP-W, extensamente discutido por Cell et al (CELA et al, 1996 a; 1996 b; 1996c; 1996d). Ambos são programas que utilizam uma metodologia semi empírica, aonde se inserem em suas interfaces dados de retenção de corridas preliminares para conseqüente cálculo e simulação de cromatogramas.

Existem ainda no mercado programas com metodologias Ab Initio, como o CromWin (TRAPP et al, 2001a; TRAPP, SCHURING, 2001; TRAPP, SCHURING, 2002). As metodologias Ab Initio (HANAI, 2004) são simulações que requerem dados mais complexos relacionados ao sistema a ser simulado e nem sempre reproduzem de forma adequada o comportamento do sistema analizado.

O pacote de programas HIPAC (Phenomenex, Torrance, USA), com seus módulos HIPAC-B, HIPAC-S, HIPAC-G , possui abordagem semi-empírica, precisando apenas de algumas poucas corridas experimentais preliminares para as simulações dos cromatogramas, fornece mapas de retenção, bem como sumários com dados pertinentes aos experimentos. O

cálculo. Suas simulações são computadas de forma ágil e possui variada aplicabilidade aos diversos modos de análise de CLAE. Vale destacar o menu de ajuda que compila de forma prática tanto o arcabouço teórico necessário para lidar com simulação cromatográfica bem como informação sobre a técnica cromatográfica. O programa HIPAC pode ser usado como ferramenta educacional, facilitando a tarefa dos instrutores na formação dos usuários, reforçando o aprendizado e refino da experiência do cromatografista (RITTENHOUSE, 1988).

Nos experimentos realizados em laboratório observou-se excelente correlação entre os dados das predições com os dados experimentais variando de 0,8802 a 1 (Tabela 06), comprovando que o software faz cálculos e predições com grande precisão. Entretanto nem sempre as predições eram as mais adequadas quanto a resolução global (Rs) variando entre 0,08 a 1,51.

Picos muito sobrepostos em todas as predições geralmente envolvendo 3-O-[β-D- glicopiranosil-(1→6)-α-L-ramnopiranosil]-7-O-α-L-ramnopiranosilkanferol (SAS1336) e hesperidina ou envolvendo kanferol, tilirosídeo e quercetina.

Em algumas outras predições o tempo necessário para obter a melhor resolução era extremamente proibitivo para exames de rotina laboratorial e rigores das demandas da indústria. (Figuras 105 e, 112, e 129).

O programa na modalidade de simulação de modo gradiente em multi passos (HIPAC-G) mesmo em computador com configuração de sistema adequado travou ao tratar grande influxo de dados (Overflow), problema pouco freqüente que não prejudicou os testes de simulação, bastando reiniciar a partir do arquivo de dados já salvo.

Percebeu-se a diferença de área em alguns picos em relação ao cromatograma predito com o cromatograma simulado, explicado pela pouca quantidade disponível de algumas amostras dos padrões individuais, e o constante preparo da mistura de oito flavonóides possuindo concentrações cada vez mais diluídas dos padrões em falta.

Nos experimentos não se obteve separação adequada de todos os 8 flavonóides da mistura, entretanto, isto não tira o mérito do pacote de programas HIPAC em direcionar o pesquisador no desenvolvimento de métodos de CLAE.

Vale ressaltar que de forma alguma um programa de otimização de métodos de CLAE poderia substituir o cromatografista, grande parte em razão da experiência e capacidade de adaptação do especialista aos diversos desafios científicos relacionados a técnica de analise por CLAE.

Tabela 3. Sumario das correlações médias obtidos da comparação dos dados preditos com os dados das corridas experimentais. Correlações Médias (r 2₎ Condições Cromatográficas ACN, C18 250mm x 4,6mm, 5 m MeOH, C18 250mm x 4,6mm, 5 m MeOH, C8, 150mm x 4,6mm, 5 m

Módulos HIPAC HIPAC-G HIPAC-G

HIPAC-B HIPAC-S HIPAC-G HIPAC-B HIPAC-S

Predições Single Step Multi Step Single Step Multi Step Single Step Multi Step

1 0,9967 - - - - 2 0.9984 - - - - 3 0.9919 - - - - 4 0,9846 - - - - 5 0,9960 - - - - 6 0,9985 - - - - 7 0,9988 - - - - 8 0,9992 - - - - 9 - 0,9603 - - - - 10 - - 0,9895 - - - - 11 - - - 0,8802 - - - - 12 - - - - 0,9999 - - - - - 13 - - - 1 - - - - 14 - - - 0,9787 - - - 15 - - - 0,9906 - - 16 - - - 0,9999 - 17 - - - 1

5. CONCLUSÕES

 As condições para o uso de modo gradiente de CLAE para separação de uma mistura de oito flavonóides foram otimizadas usando o programa HIPAC-G. Com alguns poucos resultados experimentais definiu-se a escolha de um gradiente adequado para separação satisfatória das substâncias em um curto espaço de tempo. A resolução global variou de 1,13 a 1,51 traduzindo se em significativa resolução de muitos pares de constituintes, comprovada pela excelente correlação entre os dados das predições com os dados experimentais variando de 0,9846 a 0,9992.

 HIPAC-G demonstrou ser muito adequado para o desenvolvimento de método de CLAE envolvendo uma mistura de substâncias razoavelmente complexa de variadas faixas de fator de retenção (k). Destaca-se ainda pelo modo de otimização em multistep (Multipassos) que conduziu ao aumento de resolução global e diminuição do tempo de análise da amostra nos testes; apresentando ótima correlação entre os dados das predições com os dados experimentais variando de 0,8802 a 0,9603.

 HIPAC-B possui varias ferramentas que auxiliam o cromatografista em sua pesquisa, desde calculadora de pratos teóricos (N) e resolução global (Rs), valores de fator de retenção (k) e scan de gradientes (para verificação da viabilidade de modo gradiente para as amostras analisadas). Os dados das predições apresentaram excelente correlação com os dados experimentais, variando de 0,9999 a 1.

 HIPAC-S acabou desempenhando um papel importante sugerindo corridas com razoáveis resoluções globais, entretanto com elevado gasto de tempo tornando inviável o método para exames de rotina laboratorial; apresentou excelente correlação entre os dados das predições com os dados experimentais com o valor de 1 em ambos os experimentos realizados com HIPAC-S.

 Todas as corridas sugeridas pelos módulos dos programas HIPAC-G, HIPAC-B e HIPAC-S demonstraram grande compatibilidade entre os dados experimentais e os dados preditos. Apesar disso, nem todas as corridas experimentais separaram de forma adequada os constituintes, apresentando leve sobreposição em alguma delas;

 A melhor separação ocorreu na corrida cromatográfica relacionada a predição 8, nas seguintes condições sugeridas pelo software: 250 x 4,6mm, 5 m C18;; ACN-Água,

gradiente de 26 a 61%B em 47min. Obteve-se a maior resolução global, no valor de 1,51; o que indica uma melhor separação entre os analitos. Entretanto, o tempo de análise, foi o maior de 48 minutos.

 O pacote de softwares HIPAC é uma ferramenta adequada para auxiliar um cromatografista a desenvolver de forma ágil uma vasta composição de possibilidades cromatográficas. Assim, experimentos que normalmente seriam muito dispendiosos podem ser efetuados mais rapidamente, com economia de tempo ao desenvolver o método bem como viabilizar economicamente os exames.

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