Este experimento seguiu a metodologia descrita no artigo de Baggio et al., (2002),
com algumas modificações. Foram utilizados camundongos fêmeas Swiss, pesando cerca de
30g, submetidas a um jejum de 6h (água ad libitum). Primeiramente, foram realizados os tratamentos com: veículo; atropina 15mg/Kg (controle positivo) e com a droga-teste todos por
via oral. Depois de 30 minutos o carvão ativado foi administrado em todos os grupos, também
por via oral. Após 30 minutos foi feito o sacrifício dos animais, por deslocamento cervical. O
intestino dos animais foi retirado e, com a ajuda de um peso fixado em sua porção inferior,
foram colocados em uma régua vertical, para determinação do comprimento total do intestino
e da distância percorrida pelo carvão ativado, ambos em cm. A porcentagem percorrida foi
calculada e transformada em arc sen para análise estatística.
III.4- TOXICIDADE AGUDA E “SCREENING” HIPOCRÁTICO
Este experimento seguiu a metodologia descrita por (Souza-Brito, 1995). Foram
utilizados camundongos machos Swiss e divididos em 2 grupos: um grupo tratado com o
veículo (salina) e os demais tratados com a dose 5000 mg/Kg do extrato. Os tratamentos
240 e 360 minutos após a realização dos tratamentos, bem como o número de mortes. O peso
corporal dos animais foi avaliado diariamente por 14 dias após o início dos experimentos. No
décimo quarto dia, os animais foram sacrificados e os seguintes órgãos retirados: coração,
fígado, pulmões e rins. Eles foram pesados para se realizar uma determinação analítica e
comparativa dos órgãos em relação aos animais submetidos ao tratamento com salina
indicando possíveis efeitos tóxicos agudo do extrato vegetal.
III.5- ATIVIDADE CICATRIZANTE:
O experimento foi realizado segundo metodologia de Takagi et al., (1969) e Okabe e
Amagase (2005). Ratos foram submetidos a jejum de 24 horas, em seguida foram pesados e
anestesiados para o procedimento de indução de úlcera gástrica. Foi feita uma incisão
longitudinal logo abaixo da apófise xifóide, a parede anterior do estômago foi exposta e um
volume de 0,02 mL de ácido acético a 20% foi injetado na camada submucosa da junção do
fundo com o antro, onde imediatamente formou-se a úlcera. Em seguida, realizou-se a sutura
e os animais foram mantidos em caixas de contenção normais, com alimento e água ad
libitum. A contar do dia seguinte desta operação e durante 14 dias, animais foram tratados
com veículo (controle negativo), com Cimetidina (droga antagonista do receptor H2) 100 mg/Kg (controle positivo) e foram tratados com a droga-teste, uma vez por dia. No 15° dia,
todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram seus estômagos
retirados para avaliação da área de cicatrização.
A) Análise morfológica:
Os estômagos foram abertos no sentido da maior curvatura, de modo que permitiu a
lesão e r = raio menor da lesão). Avaliaram-se também os possíveis efeitos tóxicos através de
análise macroscópica e pesagem de órgãos vitais como baço, coração, fígado, pulmões e rins.
Após cuidadosa fixação em placa de isopor com alfinetes, o material foi fixado em
solução de ALFAC (formalina, álcool 80%, ácido acético), onde ficou imerso por 24 horas a 4
ºC. As peças foram desidratadas e incluídas em paraplast. Posteriormente, os blocos de
paraplast foram cortados em 7 µm de espessura em micrótomo de maneira semi-seriada. As
lâminas obtidas segundo esse processo foram submetidas à coloração por ácido periódico de
Schiff (P.A.S.) (Vacca, 1985) hematoxilina, hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson
(Behmer et al., 1976), para análises morfológica e morfométrica em microscopia de luz.
B) Imunohistoquímica:
Para análise imunohistoquímica foi utilizada uma lâmina representativa de cada
tratamento que foi desparafinizada, re-hidratada e destinada a imunohistoquímica com método
de revelação para peroxidase. O bloqueio de reação inespecífica foi feito com leite desnatado
e soro normal de carneiro, posteriormente à recuperação antigênica conforme indicação da
tabela 1 e as amostras foram incubadas com aos anticorpos específicos (ver tabela 1) em
solução de bloqueio “overnight”. Posteriormente, as amostras foram lavadas em tampão
fosfato (0.01 mol/L, pH 7.4) e incubadas em anticorpo secundário (Kit ABC Vector) e
revelado com o Avidina-Biotina associado com 3-3`diaminobenzina tetrahydrochloride
(DAB, Sigma), e analisadas posteriormente no microscópio LEICA DM acoplado com o
software de captura de imagens Leica QWin Standard Versão 3.1.0 Abril de 2004, Reino
Unido.
Anticorpo Código Empresa Titulação Recuperação antigênica
Referência
PCNA NCL-PCNA Novo Castra 1:100 Citrato+ MW Kitajima et
al., 1993
HSP70 SC-1060 Santa Cruz
Biotechnology
1:100 Não necessita Guo et al.,
2002
COX 2 160106 Cayman
Chemical
1:200* Citrato+ MW Berenguer
et al., 2002
Gastrina SC-7783 Santa Cruz
Biotechnology
1:20 Não necessita Ku et al.,
2005
Somatostatina SC-7819 Santa Cruz
Biotechnology
1:20 Não necessita Ku et al.,
2005
*= Recomendado pela empresa
Citrato+ MW= Tampão citrato 0,01 M com irradiação em forno de microondas.
PCNA – antígeno nuclear de células em proliferação, usado para determinação de
células em divisão, principalmente na fase S do ciclo celular.
HSP70 - HEAT SHOCK PROTEIN 70 – é uma proteína da família HSP presente nas células de mamíferos, com peso molecular aproximado de 70 kDa.
COX 2- é uma enzima induzida e expressa em lesões por algumas células do processo
inflamatório ou agentes mitogênicos (Halter et al., 2001; De Maria et al., 2003; Motilva et al.,
2005).
Gastrina e Somatostatina são hormônios que regulam a secreção, motilidade, absorção,
C) Análise morfométrica (Ishirara e Ito, 2002)
Essa análise foi realizada no analisador de imagens Leica Q-Win Standard Versão 3.1.0
(Reino Unido) no laboratório de imagens do Departamento de Morfologia. Foram feitas
medidas lineares da luz até a muscular da mucosa na área de transição da lesão e na área
normal.