2. KURAMSAL TEMELLER
2.1. Ovaryum
2.1.6. İntersitisyel Hücreler
Folikül atrezisi esnasında granuloza hücreleri ile oositler çözülüp bozulmasına rağmen, teka interna hücreleri korteks stromasında çoğu kez tek ya da küçük gruplar halinde kalır (Junqueira ve Carneiro 2003). Bu hücreler, poligonal şekilli, ortada yuvarlak çekirdeği ve belirgin çekirdekçikleri olan epiteloid hücrelerdir ve intersitisyel hücreler adını alırlar. Sitoplazmalarında küçük yağ damlacıkları bulunur. Ayrıca intersitisyel hücreler granuloza hücrelerinden ve primordiyal folliküllerden de köken alırlar. Bunlar LH tarafından uyarılarak östrojen (steroid) salgılarlar (Tanyolaç 1999, Junqueira ve Carneiro 2003).
17 2.2. Tamoksifen
İlk kez 1896 yılında ileri evre meme kanserinin tedavisinde ovorektominin (ovariectomy) etkili olduğu gösterilmiştir. Overlerin endokrin fonksiyonu ise ilk kez 1923 yılında St. Louis’ de Dr. Ailen ve Dr. Daisy tarafından tespit edilerek over kaynaklı bu kimyasal maddelere östrojen (estrus=çılgınlık) adı verilmiştir (Ailen ve Doisy 1923). Overlerin cerrahi olarak çıkarılması veya radyoterapi ile ablasyonu 1950’
li yıllarda hem metastatik hastalığın tedavisinde hem de adjuvan uygulamalarda standart tedavi olarak kabul görmüştür. 1966 yılında Chicago Üniversitesi' nde östrojen reseptör proteini ilk kez bir sıçan uterusundan izole edilmiştir. 1971 yılında meme kanseri hücrelerinin bir kısmında östrojen reseptörü bulunduğu ve östrojen reseptörü bulunan tümörlerin endokrin tedaviye daha iyi yanıt vereceği fikri ortaya atılmıştır (Jensen ve ark. 1971). Östrojen reseptörü taşıyan tümörlerin endokrin ablasyona % 60 oranında yanıt verdiğinin gösterilmesi ile umutlar iyice artmış ve bunun için östrojenin meme dokusundaki etkilerini bloke edecek yeni bir antiöstrojen ajan araştırılmaya başlanmıştır. İlk antiöstrojen bileşik olan Etamoksitrifetol 1958 yılında sentez edilmiştir (Lemer ve ark. 1958). Ancak şiddetli yan etkileri nedeniyle kullanımı kısıtlı olmuştur.
İlerleyen çalışmalarla birlikte daha sonra yeni ve daha az yan etkiye sahip bir antiöstrojen olan Tamoksifen (TAM) geliştirilmiştir. Yapılan ilk çalışmada 46 postmenopozal ileri evre meme kanserli hastada denenen ilaç, 10 hastanın olumlu yanıt vermesi ile popülarite kazanmıştır (Cole ve ark. 1971). Bir nonsteroid antiöstrojen olan TAM’ ın diğer antiöstrojenlere oranla daha güçlü bir antitümor etkisi ve daha az sistemik etkilerinin olmasından dolayı kullanımı artmıştır. TAM 1973 yılında Nolvadex piyasa adıyla ilerlemiş meme kanserinin tedavisi amacıyla İngiltere' de piyasaya çıkmış, 1977’ de postmenopozal kadınlarda metastatik meme kanseri tedavisi için Amerika’ da FDA (Food Drug Administration) onayı almıştır (Wyld ve ark. 1998). TAM’ ın östrojen reseptör pozitif premenopozal meme kanserli hastalarda, sağ kalım şansını arttırdığının ve karşı memede meme kanseri gelişimini azalttığının çalışmalarla gösterilmesi 15 yıl almıştır (Ward 1973). Selektif östrojen reseptör modülatörlerinin atası sayılan TAM, meme dokusu üzerine antiöstrojenik etki gösterirken (Ward 1973), serum lipitleri (Saarto ve ark. 1996), kemik (Love ve ark. 1994) ve endometriyum (Decensi ve ark.
1996) üzerine belirgin östrojenik etki göstermekte ve buna bağlı olarak TAM kullanan hastalarda endometriyal patoloji gelişme riski artmaktadır (Barakat ve ark. 1995). TAM
18
hem premenapozal hem postmenapozal hastaların tedavisinde yüksek oranda kullanılmaktadır (Goldrisch ve ark. 1991, Sunderland ve Osborne 1991). Günümüzde TAM, meme kanserine karşı yüksek risk taşıyan sağlıklı kadınların profilaksisinde (Powles ve ark. 1990), iyi huylu meme hastalıklarının tedavisinde (Fentiman ve Powles 1987) ve infertil kadınlarda ovulasyon indüksiyonunda (Weseley ve Melnick 1987) kullanılmaktadır.
2.2.1. Etki Mekanizması
Meme kanserinde endokrin tedavinin temel prensibi, tümör hücresinin östrojenlerin (Estron (E1) , Estradiol (E2) , Estron sülfat (E1s) ) büyümeyi uyarıcı etkisinden yoksun bırakılmasıdır. Normal meme dokusunun büyüme ve çoğalması esas olarak östrojen ve prolaktin hormonları tarafından düzenlenir (Love ve ark. 1994).
Meme kanserinin ortaya çıkmasından ve ilerlemesinden primer olarak östrojenler sorumludur (Trichopoulos ve ark. 1983, Love ve ark. 1994). İlk kez 1975 yılında TAM’ ın kültür ortamında östrojen reseptörü taşıyan meme kanseri hücrelerini inhibe ettiği ve bu etkinin ortama östrojen ilave edildiğinde geri döndürülebildiği gösterilmiştir (Lippman ve Bolan 1975). Bundan yaklaşık 10 yıl sonra birbirinden bağımsız olarak TAM’ ın meme kanseri hücrelerini siklüsün G1 fazında bloke ettiği tespit edilmiştir (Osborne ve ark. 1983, Sutherland ve ark. 1983). TAM östrojen reseptörüne bağlandığı zaman reseptörde üç boyutlu bir değişmeye neden olmakta ve DNA’ daki östrojen bağlanmasını inhibe etmektedir. Normal fizyolojik koşullarda östrojen stimülasyonu, tümör hücre ürünü transforming growth faktör β’ yı (TGF-β) arttırmaktadır. TAM tümör hücre büyümesinin otokrin inhibitörüdür. Bu yolları bloke eden TAM’ ın net etkisi meme kanseri büyümesinin otokrin stimülasyonunu hücreyi G1 fazında bloke ederek azaltmaktır. Buna ek olarak insülin benzeri büyüme faktörü 1’
in (IGF-I) lokal oluşumunu da azaltır. IGF-I meme kanseri için parakrin büyüme faktörüdür (Gilman 1996). TAM daha çok tümorstatik bir ilaç olduğundan ve kısa süreli tedavi sonrası TAM kesildiğinde tekrarlanabilme ihtimali olduğundan uzun süreli tedavinin (en az 5 yıl) en iyi klinik strateji olduğu belirtilmektedir (Jordan ve ark.
1979, Jordan 1983). 5-10 yıllık kullanım sonucunda TAM’ a karşı herhangi bir tolerans gelişmezken, daha kısa süreli kullanımlardan sonra nükslerin görülme sıklığının arttığı
19
bildirilmektedir (Jordan 1978). Sonuç olarak, TAM’ ın meme kanserinde hayatta kalım oranını %10 arttırdığı düşünülmektedir.
2.3. İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü
İnsülin benzeri büyüme faktörleri (IGF-I ve IGF-II), ilk olarak 1957'de Salmon ve Daughaday tarafından (Salmon ve Daughaday 1957) sıçan kıkırdağına -sülfatın katılmasını stimüle etme kabiliyeti ile "sülfatlayıcı faktör" olarak tanımlanmıştır (Laron 1971). Froesch ve ark. (1963) ise IGF’leri, iki serum bileşeninin (NSILA I ve II) baskılanamayan insülin benzeri aktivitesi (NSILA) olarak tanımlamışlardır (Froesch ve ark. 1963). 1972'de, sülfatlayıcı faktör ve NSILA tanımlamalarının yerini
"somatomedin" terimi almıştır (Daughaday ve ark. 1972). Rinderknecht ve Humbel (1976) proinsülinin yapısal benzerliklerine bağlı olarak "insülin benzeri büyüme faktörü 1 ve 2" (IGF-I ve II) olarak yeniden isimlendirilen iki aktif maddeyi insan serumundan izole etmişlerdir (Laron 1999). Dolaşımdaki IGF'nin asıl kaynağı karaciğer olsa da, pek çok dokuda olduğu gibi, özellikle doğum sonrası gelişim esnasında, geniş çapta ifade oldukları görülmektedir (Daughaday ve Rotwein 1989).
IGF'ler relaxin protein hormonunu da içeren insülinle bağlantılı peptid ailesinin bir üyesidir (Blundell ve Humbel 1980). IGF sistemi pek çok elemanın birleşimi ile meydana gelmektedir. Sistem iki adet ligand (IGF-I ve II) ve iki adet reseptör içermektedir. IGF-IR insülin reseptörüne yüksek homoloji gösteren ancak daha yüksek konsantrasyonlara sahip tirozin kinaz ailesinin bir transmembran reseptörüdür (Şekil 2.3.) (Izadyar ve ark. 1998). İnsülin reseptörü (IR) karaciğerde, yağ ve kas dokusunda baskınken, IGF-IR hemen hemen bütün hücre tiplerinde baskındır ve genellikle fibroblastlar, kontrositler ve osteoblastlarda çok daha yaygın bulunmaktadır (Kritsch 2000).
20
Şekil 2.2. İnsülin ve Insülin benzeri büyüme faktörü 1 reseptörü (IGF-IR) arasındaki benzerlik (Laron 2001).
2.3.1. İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü I (IGF-I)
IGF-I, 7649 kDa'lık molekül ağırlığına sahip, 70 amino asitten oluşan küçük bir peptiddir (Daughaday ve Rotwein 1989). IGF-I, insülin'e benzer şekilde, disülfid bağlarıyla bağlı A ve B zincirine sahiptir. C-peptid bölgesi IGF-I de 12 amino asitten meydana gelmektedir. IGF-I'in insüline yapısal benzerliği, insülin reseptörüne bağlanma kabiliyetini de (düşük afinite ile) açıklamaktadır (Laron 2001).
IGF'ler birçok hücre tipinden hormon sentezlemesinde rol oynarlar. IGF-I ve IGF-II, ovaryumun granuloza ve teka hücrelerinden hormon sentezini ve sekresyonunu uyarır ayrıca FSH ve östrojen ile birlikte karşılıklı sinerjik etkiler göstermektedir (Giudice 1992). Timus epitel hücreleri tarafından timulin hormonun salgısı da yine IGF-I tarafından stimüle edilmektedir (Timsit ve ark. 1992). Adrende fasikülata hücrelerinin IGF-I ile tedavisi ACTH reseptör sayısını arttırır ve ACTH'ye yanıt olarak steroid hormon sentezini güçlendirir (Penhoat ve ark. 1989). Diğer bir taraftan, bu hücrelerin ACTH ile tedavisi IGF-I sentezini uyarır; bu sentez ACTH etkisini daha da güçlendirmek için bir otokrin faktör olarak mevcuttur (Penhoat ve ark. 1989). IGF-I
21
aynı zamanda Leydig hücrelerinden ve tiroid folikül hücrelerinden hormon sentezlenmesini uyarmaktadır (Lowe 1991).
IGF'ler geniş ölçüde pek çok hücreye özgü işlevi de etkileyebilir. Örneğin in vitro olarak hipofiz somatotropinlerinde, IGF-I doğrudan GH sentezini inhibe eder (Yamasaki ve ark. 1991). Ayrıca, IGF-I ve IGF-II, IGF-I reseptörü aracılığıyla, immünoglobülin E'ye yanıt olarak bazofillerden histaminin salınmasını güçlendirir (Koshino ve ark. 1993). Purkinje hücrelerinde ise IGF-I, 7-amino bütirik asitin glutamat uyarımıyla salımını engelleyerek bu hücreler için in vivo olarak bir nöromodülatör olarak işlev görebilir (Castro-Alamancos ve Torres-Aleman 1993). Bunun yanısıra, IGF-I değişiminin T lenfositlerde (Tapson ve ark. 1988), bronşiyal epitel hücrelerinde (Shoji ve ark. 1990), endotel hücrelerinde (Grant ve ark. 1987), melanom hücrelerinde (Stracke ve ark. 1989) ve retinal pigment epitel hücrelerinde (Grant ve ark. 1990) kemotaktik migrasyonu arttırdığı bildirilmiştir. Bununla birlikte, insan rhabdomiyosarkom hücrelerinde, IGF-II'ye kemotaktik bir cevaba karşı IGF-II reseptörünün aracılık ettiği gösterilmiştir (Minniti ve ark. 1992). IGF-I ayrıca keratinositlerin göçünü de uyarmaktadır (Ando ve Jensen 1993). IGF'lerin metabolik etkileri, mitojenik etkilerden farklı yolaklarla sağlanır ve bazı hücrelerde reseptör tirozin kinaz aktivitesinin uyarılması gerekmeyebilir (McClain ve ark. 1990). Fonksiyonel IGF-I reseptörlü hücrelerin çoğunda, IGF-IGF'ler belli bir dereceye kadar amino asit, glikoz alımını ve genel protein sentezini uyarmaktadır. İskelet kasında in vitro çalışmalarda, IGF-I'in, glukoz alımı, glikoliz ve glikojen sentezi üzerinde insülin benzeri uyarıcı etkilere sahip olduğu fakat insülinin aksine glikoz oksidasyonunu uyarmadığı gösterilmiştir (Dimitriadis ve ark. 1992). IGF-I, ekstrasellüler matriks (ECM) proteinlerinin, özellikle kollajenlerin ve proteoglikanların sentezini arttırmak için kondrositleri (Trippel ve ark. 1989, Hill ve ark. 1992), osteoblastları, fibroblastları ve endotel hücrelerini de uyarır (Lowe 1991). IGF'nin hareket mekanizmasında somatomedin modeli, GH'nün IGF-I seviyelerini kontrol altında tuttuğunu ve IGF-I' in direkt olarak hücresel seviyede hareket ettiğini öngörmüştür. Başlangıçta somatomedinlerin GH'e cevap olarak karaciğer tarafından sentezlenen dolaşımdaki hormonlar olarak işlev gördüğü düşünülmekteydi. Bazı dokulardaki IGF-I mRNA düzeyleri ve lenfdeki peptid konsantrasyonlarının GH ile tedaviden sonra arttığı
22
gösterilmiştir dolayısıyla dokulardaki IGF-I seviyeleri GH'na da bağımlıdır (Roberts ve ark. 1987, Davis ve ark. 1992). IGF-I yaygın olarak lokal bazda sentezlenir ve dokularda potansiyel bir parakrin-otokrin etkiye sahiptir. Epifizyal büyüme plağı (Jennische ve ark. 1992), ovaryum (Giudice 1992) ve böbrek (Chin ve ark. 1992) gibi lokal IGF-I sentezinin yapıldığı dokularda kısmen GH ile düzenlenir, böylece endokrin seviyelerinin yanısıra somatomedin modeli de her iki otokrin / parakrin mekanizması için de geçerliliğini korur.
Östrojen sentezini kontrol ettiği görülen uterus gibi diğer dokularda (Murphy ve ark.
1987), IGF-I ekspresyonu GH'dan bağımsızdır. IGF-II,’nin ekspresyonunun düzenlenmesi ise, çoğunlukla GH'den bağımsızdır. Hem IGF-I hem de IGF-II ekspresyonun GH'dan bağımsız olduğu durumlarda, fötal gelişim sırasında baskın olarak mezenkimal orijinli hücreler tarafından dokularda ekspre olur (Han ve ark.
1992). IGF-I seviyeleri GH'ye bağımlı hale geldiğinde, serum seviyeleri doğum sonrası yaşamda çok daha düşüktür (Daughaday ve Rotwein 1989). Fötüste IGF hareketi bu nedenle çoğunlukla otokrin / parakrin ve GH'den bağımsızdır.
2.3.2. İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü-I Reseptörü (IGF-IR)
Glikoprotein yapıdaki IGF-IR hücre membranında konumlanmıştır. IGF-IR, iki özdeş α-altbiriminin ve iki özdeş β-altbiriminin tetrameridir (LeRoith ve ark. 1995, Stewart ve ark. 1996, Sepp-Lorenzino ve ark. 1998). Yapısal olarak, IGF-IR, insülin reseptörünü andırır ve aralarında % 60 homoloji bulunur. IGF'ler ve insülin, tercih edilen ligand haricinde çok daha zayıf bağlanma afinitesine sahip olsa da birbirlerinin reseptörüne çapraz bağlanabilmektedir (Steele-Perkins ve ark. 1988, Frattali ve ark. 1993).
IGF-IR’ ün İnsülin reseptörü ile benzerliği, IGF-IRα’nın bolca sistein içeren bir hormon bağlama bölgesine sahip olmasından ve IGF-IRβ’nın tirozin kinaz aktiviteli sitoplazmik bölgesinden kaynaklanmaktadır (Baserga 2000). İnsülin benzeri büyüme faktörü I’in reseptörüne (IGF-IRα altbirimine) bağlanması; tirozin fosforilasyonu ile birlikte insulin-reseptör substrat-1 (IRS-1) ve Shc gibi adaptör proteinlerin fosforilasyonuna neden olur (Dudek ve ark. 1997). Böylece proliferatif ve antiapoptotik bir sinyal başlar sonuçta hücrenin çoğalmasında ve hayatta kalmasında rol alan Ras / Raf / mitojen-aktive edici
23
protein kinaz (MAPK)’ın ya da fosfatidilinositol-3 kinaz (PI-3K) yolağının aktivasyonu gibi insilün reseptörünün etkilerine benzer olaylar meydana gelir (Poretsky ve ark.
1999). IGF-IR ifadesi steroid hormonları ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir (Stewart ve ark. 1996, Sepp-Lorenzino ve ark. 1998). Yüksek I seviyeleri, IGF-IR'de düşüşe neden olduğundan, IGF'ler IGF-IR ifadesini baskılamaya yönelik negatif feedback sinyalleri şeklinde görev yapabilir (Yang ve ark. 1996, Hernandez-Sanchez ve ark. 1997). IGF'lerin etkisinin tersine, bazik FGF, PDGF ve EGF de dahil olmak üzere diğer büyüme faktörleri IGF-IR ekspresyonunu uyarır (Rosenthal ve ark. 1991, Rubini ve ark. 1994, Sepp-Lorenzino ve ark. 1998). IGF-IR ekspresyonu ayrıca östrojen, glukokortikoidler, GH, FSH, luteinize edici hormon ve tiroid hormonları tarafından da uyarılır (LeRoith ve ark. 1995, Sepp-Lorenzino ve ark. 1998). IGF'lerin IGF-IR'ye bağlanması, sinyal iletim yolunda pek çok melekülün reaksiyon kaskadını tetiklemenin yanı sıra reseptörün tirozin kinaz aktivitesini aktive eder. IGF-IR için iki farklı sinyal iletim yolu belirlenmiştir. Birinci yol; Ras proteinini, Raf proteinini ve Mitojen-aktiviteli protein kinazı (MAPK)’ı aktive eder. Bu yolun aktivasyonu hücre büyümesi, gelişimi ve çoğalmasına bağlıdır. İkinci yol ise Fosfodiinotositol 3-kinaz (PI3-kinaz) ve Akt aktivasyonunu içerir. Bu yolun aktivasyonu ise hücre metabolizması, büyümesi ve antiapopitotik süreçlere bağlıdır (Jones ve Clemmons 1995, LeRoith ve ark 1995).
MAP-kinaz (ERK-1-2) transkripsiyon faktörlerini aktive eder. Ayrıca DNA sentezini ve IGF-I stimülasyonu ve mitogenezisi düzenlediği bilinmektedir. PI3-kinaz glikoz transportunun stimülasyonu, protein ve gikojen sentezi, apoptozisin inhibisyonu, IGF-I ve insülinin metabolik büyüme ve fonksiyonel etkilerinin taşınması için etkilidir (Saetrum ve Wang 2005). Bunun dışında IGF-IR ile başlatılan diğer sinyal iletim yollarının varlığıda muhtemeldir (Lopaczynski 1999). Ligand bağlanması ile IGF-IR'nün aktivasyonu, IGF'lerin aktivitesine aracılık etmesini sağladığı için gereklidir.
IGF'lerin mitojenik ve antiapoptotik etkilerine aracılık etmenin yanı sıra IGF-IR hücre dönüşümünde de etkin rol oynamaktadır. In vitro deneyler, IGF-IR genini ortadan kaldırarak, hücre ekspresyonunu baskılayarak veya fonksiyonunu inhibe ederek hücre zarından IGF-IR'nin uzaklaştırılmasının hücre transformasyonunu ortadan kaldırabileceğini göstermiştir (Baserga 1995).
24 2.3.3. IGF Bağlayıcı Proteinler (IGFBP)
Plazmada, IGF'lerin % 99'u, serbest IGF-I'in dokulara uygunluğunu modüle eden bir bağlayıcı protein ailesi ile kompleks oluşturmaktadır. Hem IGF-I'in hemde IGF-II' nin kontrolünde biyolojik olarak kullanılabilen, yüksek afinite ile bağlanmasına yardımcı olan altı adet bağlayıcı protein bulunmaktadır (Baxter 2000). IGFBP’ler tüm biyolojik sıvılarda bulunmaktadır ve iki grupta sınıflandırılabilmektedir: (1) serumda bulunan IGFBP-l, -2, -4, -5 ve -6 (24-35 kDa); ve (2) serumda en baskın IGFBP olarak kabul edilen IGFBP-3'tür. Bu sıvıdaki IGFBP-3 ağırlıklı olarak IGF-I veya -II'den oluşan ve aside dayanıksız olarak 85 kDa altbiriminden oluşan 150 kDa formunda bulunur.
Serumda IGFBP-I ve -II'nin konsantrasyonları negatif olarak düzenlenip GH'dan etkilenmezken, IGFBP-3'ün konsantrasyonu GH ve IGF-I ile pozitif olarak düzenlenir (Monget ve ark. 2002). IGFBP'ler, IGF'lerin hedef hücrelerdeki hareket aktivitesini inhibe edebileceği gibi güçlendiredebilir. IGFBP'lerin IGF-I ve -II için afinitesi tip I reseptörünün afinitesi ile aynı sıralamaya sahiptir dolayısıyla IGF'lerin hareket mekanizmasını engelleyerek bunların etkisini inhibe edebilirler. Bununla birlikte IGFBP'ler ECM'ye (ekstra selüler matrikse) (IGFBP-5) bağlandığında veya proteolize girdiklerinde (IGFBP-3 ve 4) GFBP'lerin IGF'lere afinitesi azaltılabilir (Spicer 2004).
Bu proteoliz, hücre zarı seviyesinde meydana gelebilir (Baxter 2000). IGF'lerin biyo yararlanımının artması, IGF'lerin IGFBP'ler için afinitesini azaltabilir ve bu durum ligandların hareketinde bir inhibisyondan ziyade bir potansiyelizasyona neden olabilir (Monget ve ark. 2002). Genel olarak, IGFBP'lerin IGF aktivitelerinin düzenlenmesinde dört temel fonksiyonu vardır: 1; plazmada transport proteinleri olarak davranabilirler, 2;
metabolik klirenslerini düzenleyerek IGF'lerin yarı ömrünü uzatırlar, 3; Doku ve hücre tipine spesifik hedefleme mekanizmasında rol alır ve 4; doğrudan IGF'lerin reseptörleri ile olan etkileşimini modüle ederek dolaylı yoldan biyolojik aktivitelerini kontrol eder (Silva ve ark. 2009).
25 3. MATERYAL VE YÖNTEM
Sunulan tez çalışmasında, başka materyal kullanma ilkesine uygun olarak (replacement) tekrar deney hayvanı kullanılmaması için, Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji- Embriyoloji Anabilim dalında bir önceki projede (Tübitak 112O574) aşağıdaki deneysel prosedürü uygulanan hayvanlardan elde edilen ovaryum doku blokları kullanıldı.
3.1. Deney Hayvanları ve Bakım Koşulları
Çalışma Uludağ Üniversitesi Deney Hayvanları Yetiştirme Uygulama ve Araştırma Merkezi ve Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı laboratuarında yürütülmüştür. Çalışma materyali olarak 60 adet aynı yaş ve genetik yapıya sahip (inbred) erişkin (8 haftalık) BALB/ c ırkı dişi fareler kullanılmıştır. Fareler için önerilen uygun çevresel koşullar aynı merkez tarafından sağlanmış ve fareler standart fare yemi ile beslenerek, içme suyunu serbest olarak tüketerek, ışıklandırılması 12 saat aydınlık-12 saat karanlık, havalandırılması (% 60-70 nem), oda ısısı (20-24 0C) kontrol edilen bir odaya yerleştirilmiştir. Çalışmadaki tüm deneysel uygulamalar Uludağ Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Karar no: 2012- 09/04).
3.2. Deneysel Uygulama
Fareler ortama ve deney koşullarına uyum sağlayabilmesi için deneysel uygulamanın 2 gün öncesinde kafes başına 5 fare olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kafeslerin üzerine gruplar ile enjeksiyonun başlangıç ve bitiş tarihini belirten plakalar yerleştirilmiştir.
Deney hayvanları araştırma merkezinden temin edilen hayvanlar, 3 gruba ayrılmış; I.
grup; Hayvanlara subkutan olarak (s.c.) 0.5mg/fare TAM, II. grup; 1,5mg/fare TAM ve III. grup; taşıt madde (kontrol grubu) etanol: susam yağı (%10 etanol:% 90 susam yağı) 5 gün süre ile uygulanmıştır (Zhang ve ark. 2005, Madisen ve ark. 2010). Her bir grupta 20 fare olmak üzere toplam 60 hayvan kullanılmıştır. TAM’ın dozları taşıt madde içinde hazırlanmıştır.
26 3.2.1. Dokuların Alınması
3.2.1.1. Histolojik Prosedür
Deney sonrasında, vaginal smear ile proöstrus döneminde olan hayvanlar ayrılmış ve ether inhalasyonu ile uyutulmuştur. Daha sonra hayvanların karın bölgeleri açılmış, her hayvanın sağ ovaryumu alınarak stereo mikroskop altında çevre yağ dokularından temizlenmiştir. Bu ovaryumlar numaralandırılmış kasetler içerisinde Bouin tespit solüsyonuna alınarak 24 saat tespit edilmiştir. Tespit solüsyonunda bulunan ovaryumlar değişik derecelerde alkol (% 50, 70, 80, 90, absolü), ksilol ve parafin serisinden geçirilerek, granüllü, 58-60 oC’ de eriyen parafinle bloklanmıştır.
Daha önceden bu aşamaya kadar deneysel prosedüre tabi tutulan hayvanlardan elde edilen bu ovaryum dokuları, sunulan tez projesinde kullanılmıştır. Ovaryum doku bloklarından, yarı otomatik mikrotomla 5 μm kalınlığında (Leica RM 2155, U.S.A.) 5’
er kesit alındı ve bu kesitler % 30’ luk lizinle hazırlanmış, lizinli lamlara çekildi. Her bir gruptaki ovaryum doku kesitlerinden birer tanesine ovaryumun genel yapısı incelemek amacıyla, Crossmann’ ın modifiye üçlü boyama yöntemi uygulandı (Crossmon 1937), diğer ovaryum doku kesitlerinde ise IGF-I ve IGF-IR ekspresyonunu belirlemek amacıyla immunohistokimyasal değerlendirmeler için ayrıldı.
Bouin Tespit Solüsyonunun Hazırlanışı Doymuş Pikrik Asit………..75 ml Nötr Formol………..25 ml
Asetik Asit………5 ml (Kullanılacağı zaman eklenir).
Üçlü Boyama Solüsyonlarının Hazırlanışı Weigert Hematoksilen Solüsyonu
Solüsyon A; Solüsyon B;
Hematoxylin ( Crist)………1 gr Distile su………...…90 ml
% 95 alkol………100 ml Demir-3-Klorür...1 ml HCL ……….1 ml Solüsyonlar hazırlandıktan sonra erimeleri için bir gece bekletildi.
A ve B solüsyonları eşit miktarda hazırlanıp karıştırıldı.
27 Metil Alkol (Metil Karbonat) Solüsyonu Distile su……….125 ml Metil alkol (Metanol)…………..125 ml
Sodyum karbonat………0.5 gr (Kendiliğinden erimesi için bir gece bekletildi)
Asit Fuksin Solüsyonu Fosfotungistik Asit Solüsyonu
Asit fuksin……….1.4 gr Phosphotungstic Asit…….3 gr
Distile su………...400 ml Distile su………100 ml
Tymol………...……….0.26 gr Asetik asit………..4 ml
Anilin-Blue Solüsyonu Asetik Asit Solüsyonu
Anilin-Blue………2 gr Asetik Asit……….2 ml
Distile su………....100 ml Distile su………100 ml
Asetik asit………..2 ml 3.2.1.2. Üçlü Boyama Yöntemi Deparafinizasyon ve Dehidrasyon
Ksilen : 2 x 10 dakika
%100 Alkol : 2 x 3 dakika
%96 Alkol : 3 dakika
%80 Alkol : 3 dakika
%70 Alkol : 3 dakika
%50 Alkol : 3 dakika
Distile Su : 2 x 3 dakika
Boyama
Musluk suyu : 5 dakika
Weigert Hematoksilen: 10 dakika (Çekirdek boyaması)
Musluk suyu : 5 dakika
Metil karbonat : 1 dakika
Musluk suyu : 5 dakika
Distile su : 2 x 3 dakika
28
Asit fuksin : 2 x 2 saniye (Sitoplazma Boyaması)
Distile su : 2 x 3 dakika
Fosfotunsgistik asit: 15 dakika (Mikroskopta renk kontrolü)
Distile su : 2 x 3 dakika
Anilin Blue: 2 dakika (Bağ doku boyası)
Distile su: 2 x 3 dakika
Alkol Serilerinden Geçirilmesi
% 96 Alkol 2 x 3 dakika
%100 Alkol 2 x 3 dakika
Ksilende Parlatma
Ksilen 1 5 dakika
Ksilen 2 : 10 dakika
Kapatma
Boyanan kesitler entellan ile kapatıldı.
3.2.1.3. İmmunohistokimya
Parafin bloklardan elde edilen 5-7 µm kalınlığındaki ovaryum doku kesitlerinde, TAM’ın IGF-I ve IGF-IR ekspresyonları üzerine etkisini belirlemek için, spesifik antikorlar ile indirekt Streptavidin-Biotin Peroksidaz immunohistokimyasal yöntem uygulandı ve ışık mikroskobunda incelendi.
İmmunohistokimyasal Gereçler
Primer Antikorlar: IGF-I (G-17) Santa Cruz sc: 1422 IGF-IR (C-20) Santa Cruz sc: 713
Sekonder Antikorlar: İmmPRESS anti goat Ig Peroksidaz (MP-7405).
İmmPRESS anti rabbit Ig Peroksidaz (MP-7401).
Bufferlar ve Yıkama Solüsyonu: Sitrat Buffer solüsyonu pH 6 (Sitrik asit monohydrate (Merck-100244), PBS tablet (Phosphat Buffer Saline pH 7.4), % 30’ luk hidrojen peroksit solüsyonu (Merck-K 33887597), antibody dilüent (Zymed 00-3118).
29
Kromojen: DAB (3-3 Diaminobenzidin) (Steady DAB/Plus (ab103723).
Poly-l-lysine solüsyonu (Sigma P8920-US), % 30’ luk lizin solüsyonunda hazırlanmış lizinli lamlar, lamel, entellan, mikrotom bıçağı, plastikten yapılan nemli bir ortam (nemlendirme kutusu-Işın Tıp-Türkiye).
Solüsyonlar
PBS
Sodyum klorid, NaCl : 7,20 g
Sodyum dihidrojen fosfat, NaH2PO42H2O : 0,43 g
Disodyum dihidrojen fosfat, Na2HPO42H2O : 1,48 g
Distile su : 1000 ml
Sitrat Buffer pH 6 solüsyonu
Sitrik asit: 2,1 g
Distile su : 1000 ml
pH, HCL ve NaOH ile 6’a ayarlandı.
Hidrojen Peroksit
Distile su : 64 ml
%3’lük hidrojen peroksit : 6 ml
Primer Antikor (IGF-I, IGF-IR) IGF-I: 1/150
IGF-I primer antikoru : 1ml
Antikor dilüent solüsyonu : 149 ml IGF-IR: 1/100
IGF-I primer antikoru : 1ml
Antikor dilüent solüsyonu : 99 ml
30 Substrat-Kromojen Solüsyonu
Steady DAB/Plus Buffer: 1 ml
Konsantre Steady DAB/Plus Kromojen: 20 µl (1 damla) Harris Hematoksilen
Hematoksilen krist (Hematoxylin crystals): 5g
%100 Alkol : 50 ml
100 g
1000 ml
2,5 g
Hematoksilen alkol içinde, potasyum allum sıcak distile su içinde eritildi. İki solusyon
Hematoksilen alkol içinde, potasyum allum sıcak distile su içinde eritildi. İki solusyon