3. BULGULAR
3.2 CA İzoenzimlerinin Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması
3.2.3 İnsan Eritrosit Karbonik Anhidraz İzoenzimlerinin SDS
Afinite kolonundan en iyi elüsyon tamponları ile saflaştırılan karbonik anhidraz izoenzimlerinin (hCA-I, hCA-II) saflığını kontrol etmek için, bölüm 2.2.5’de anlatıldığı gibi hazırlanan slab jel SDS-PAGE elektroforezi ile, insan eritrositlerinden saflaştırılan enzim numunelerinin protein bantları elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının fotoğrafı çekilmiştir (Şekil 3.8).
Şekil 3.8: Afinite kolonundan saflaştırılan hCA-I ve hCA-II izoenzimlerinin SDS-
41
4. TARTIŞMA VE SONUÇ
Biyolojik araştırmaların büyük bir kısmında enzimler yer almaktadır [10]. Canlı metabolizmalarında biyolojik katalizör olarak görev yapan enzimler, % 100 oranında verim sağlayarak kimyasal tepkimeleri hızlandırırlar [2].
Büyük bir kısmı protein yapısında olan enzimler değişen şartlara karşı yüksek hassasiyet gösterdikleri için enzim saflaştırması oldukça zor bir süreçtir. Substrat konsantrasyonu, pH, enzim konsantrasyonu, iyonik şiddet, sıcaklık, hormonlar, allosterik etkiler, inhibitör veya aktivatörler enzimlerin aktivitesi üzerinde etkili olan faktörlerdir [10]. Bu sebeple çalışmamızda tek basamakta yüzlerce kat saflaştırmayı mümkün kılan, biyoteknoloji, biyokimya ve tıp alanında saf enzim elde etmede tercih edilen afinite kromatografi tekniği kullanılmıştır. Ayrıca bu yöntemde kullanılan materyalin (sentezlenen jel) tekrar tekrar kullanılması mümkündür. Birkaç basamakta gerçekleşen saflaştırma işlemleri bu yöntemle tek basamakta gerçekleştirilebilmektedir.
Çalışmamızda, karbonik anhidraz izoenzimlerinin afinite kromatografisi ile saflaştırılması için farklı bir yöntem kullanarak, verimi yüksek olan orijinal bir afinite jeli sentezlenmiştir. Kullanılan afinite jeli, Sepharose-4B matriksi üzerinde hazırlanmıştır. Sepharose-4B'nin CNBr ile aktifleştirilmesinden sonra, hiçbir uzantı kolu kullanılmadan 4-(6-Amino-hekziloksi)-benzensülfonamid, doğrudan Sepharose- 4B’ye bağlanmıştır. Burada Sepharose-4B matriksi, 4-(6-Amino-hekziloksi)- benzensülfonamid ise enzimi spesifik olarak bağlayan kısmı oluşturmaktadır.
Sepharose-4B kolon materyali kullanılarak yapılan saflaştırma yöntemi basit, kullanışlı, yüksek verime sahip, hızlı ve net sonuçlar vermesi gibi özellikleri bakımından çok tercih edilmektedir.
42
Ayrıca, çalışmamızda Sepharose-4B’nin tercih edilmesinde uzun kullanım ömrünün olması, mekanik strese dayanıklılığı ve akış oranının iyi olması gibi özelliklerinden dolayı matriks olarak seçilmesinde önemli rol oynamıştır. Sentezlenen yeni afinite jelinin en büyük özelliği kısa sürede sentezleniyor olması ve matriks çok basamaklı reaksiyona mağruz kalmamasıdır. Sepharose-4B’nin CNBr ile aktifleştirilmesi sonrası yüksek pH’da 4-(6-Amino-hekziloksi)-benzensülfonamid ile bağlanması sonucu jel sentezlenmektedir. Sentez basamak sayısı azaldıkça matriksin hasar görme olasılığı düşmektedir.
Ligand olarak kullanılan 4-(6-Amino-hekziloksi)-benzensülfonamid bileşiği CA-I ve CA-II için oldukça etkili bir inhibitördür. Ki değerleri nanomolar
düzeydedir. CA-I ve CA-II için sırasıyla 63.0 ve 3.9 nM’dır [66]. Özellikle CA-II için çok etkili bir inhibitör olması ve eritrositlerde CA-I’e göre daha az miktarda bulunan CA-II enzimini saflaştırmakta çok daha etkilidir.
Çalışmalarımız boyunca, orijinal afinite jeli için denenen tüm koşulların kolon elüatları eşit hacimde alınıp, bütün fraksiyonlarda kalitatif protein tayini yapıldı. Bu metot, proteinlerin ihtiva ettikleri tirozin ile triptofan moleküllerinin 280 nm dalga boyundaki spesifik bir absorpsiyon göstermeleri prensibine dayanmaktadır [60]. Kullanılan bu metodun oldukça pratik olması ve numunenin tekrar geri kazanımına olanak sağlamasından dolayı protein tayini için bu metot kullanılmıştır.
Kantitatif protein tayini için ise uygulanabilirliğinin daha kolay oluşu, az reaktif gerektirmesi ve her çalısmada ayrı bir standart hazırlamaya ihtiyaç duyulmaması gibi avantajlarından dolayı çalışmamızda Bradford yöntemi kullanılmıştır.
Elde edilen elüatların enzim aktivitesinin belirlenmesinde Rickli ve arkadaşları tarafından modifiye edilen Wilbur-Anderson metodu kullanılmıştır [62].
43
Bu metot da, CO2’nin H2O ile reaksiyonu sonucu oluşan H2CO3 molekülünün H+ ve
HCO3- iyonlarına ayrışarak, ortamın pH’sını değiştirme süresi ölçülmektedir.
Sepharose-4B-4-(6-Amino-hekziloksi)-benzensülfonamid yapısına sahip olan afinite jeli ile saflaştırılan enzimlerin saflık kontrolü Laemmli tarafından belirtilen yönteme göre uygulanmıştır [64]. Yapılan çalışmanın sonucuna göre hem hCA-I hem de hCA-II izoenzimleri için SDS-PAGE’de tek bant elde edilmiştir (Şekil 3.6). hCA-I izoenziminin molekül ağırlığı yaklaşık olarak 30 kDa, hCA-II izoenziminin ise 29.3 kDa molekül ağırlığında olduğu tespit edilmiştir. Bulunan değerlerinde literatürle uyumlu olduğu görülmektedir [15, 29, 59, 67].
Sentezlediğimiz yeni afinite jelinin farklı pH’larda enzim tutma kapasitesini belirlemek için her bir izoenzim için 7 farklı pH’da (pH= 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5) denemeler yapılmıştır. Her iki izoenzim için maksimum bağlanma pH: 8.5’te gerçekleştiği belirlenmiştir. Literatürde yapılan diğer çalışmalara baktığımızda Bozdağ ve arkadaşları sentezledikleri Sepharose-4B-etilendiamin-4-izotiyosiyanat afinite jeli ile pH çalışmalarında CA-I için optimum bağlanma pH:8.5 iken CA-II için optimum bağlanmayı pH:9.5 olarak bulmuşlar [67]. Şahin ve arkadaşlarının sentezledikleri afinite jeli ile yaptıkları çalışmada hem CA-I hem de CA-II için optimum bağlanma pH’sını 8.5 olarak bulmuşlar [68]. Özen Özensoyun yaptığı çalışmada sentezlemiş olduğu afinite jeli CA-I için optimum bağlanmayı pH:8’de ve CA-II için de optimum bağlanmanın pH:7’de gerçekleştirmiştir[29].
Sıcaklık, enzim saflaştırmada kolon kapasitesine etki eden diğer bir parametredir. Bu amaçla 4 farklı sıcaklık (5°C, 15°C, 25°C, 35°C) değerinde her bir izoenzim için denemeler yapılmıştır. Her iki izoenzim için en uygun sıcaklık değeri 25°C bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara bakıldığında enzimlerin kolona bağlanma dereceleri sıcaklık yükseldikçe azalmaktadır. Bunun sebebi artan sıcaklığın enzimin konformasyonunda değişmelere neden olmasıdır. Ayrıca bağlanmayı gerçekleştiren grupların iyonlaşmalarının da sıcaklık artışından etkilenmesi diğer bir etkendir. Karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması için hazırlanan afinite jellerinde de
44
benzer sonuçlar görülmektedir fakat Özensoyun yaptığı çalışmada optimum bağlanma her iki izoenzim için de 5°C olarak belirlemiş [29, 67, 68].
Afinite jelinin enzim tutma kapasitesini etkileyen diğer bir parametre iyonik şiddettir. Ortamda iyon konsantrasyonu arttıkça, bağlanmada rol alan iyon halindeki gruplar, zıt yüklü gruplar tarafından sarılmakta ve adsorpsiyon engellenmektedir. Bu sebeple iyonik şiddetteki artış, enzimin kolona adsorpsiyonunu bir dereceye kadar arttırdığını göstermektedir. Her iki izoenzim içinde en uygun iyonik şiddet değeri I=0.1 dir. Daha fazla arttırılan iyonik şiddeti bağlanmayı azaltmaktadır. Bozdağ ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada sentezledikleri afinite jelinin enzimi tutma kapasitesi iyonik şiddet arttıkça arttığı görülmektedir ve her iki izoenzim için de optimum bağlanma 0.4 iyonik şiddet değerindedir[67]. Diğer bir çalışmada her iki izoenzim için optimum bağlanma iyonik şiddet değeri 0.6 iken gerçekleşmiş [29]. Şahin ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada optimum bağlanma CA-I için iyonik şiddet 0.15, CA-II için ise iyonik şiddet 0.3 olarak bulunmuş[68].
Çalıştığımız son parametre ise, farklı elüsyon tampon çiftleri kullanarak karbonik anhidraz izoenzimlerini ayırabilmektir. Bunun için dört farklı elüsyon çifti kullanılmıştır. Bu tamponlardan hCA-I için en uygun elüsyon tamponu 50 mM Na2HPO4/1 M NaCl (pH: 6.3) iken, hCA-II için 50 mM Na2HPO4/0.2 M KSCN
(pH: 6.3) elüsyon tamponudur. Bozdağ ve arkadaşları CA-I için en uygun elüsyon tamponunu . 0.1 M KI/ 0.1 M Tris-SO4 ve CA-II için – 0.1 M NaCH3COO/0.5 M
NaCIO4 elüsyon tamponunu bulmuşlar [67]. Özensoyun yaptığı çalışmada en uygun
elüsyon tamponu çiftleri olarak 50 mM Na2HPO4 / 1 M NaCl, pH:6.3 CA-I için ve
0.1 M NaCH3COO / 0.5 M NaClO4, pH:5.6 CA-II içim belirlemiştir [29].
Çalışmamızda farklı bir yöntem kullanarak, verimi yüksek olan orijinal bir afinite jeli sentezlenip insan eritrositlerinden karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri saflaştırılmıştır. Sentezlenen afinite jelinin reaksiyon süresinin kısa sürmesi ve uzantı kolunun kullanılmaması büyük bir avantaj oluşturmaktadır. Ayrıca Sepharose-4B’nin uzun kullanım ömrünün olması, mekanik strese dayanıklılığı ve
45
akış oranından dolayı matriks olarak seçilmesinde önemli rol oynamıştır. Bu özellikler geniş aralıkta proteinlerin saflaştırılmasında rutin saflaştırma işlemi için oldukça önemlidir.
Yüksek lisans olarak sunulan bu çalışmada elde edilen bulgular aşağıdaki şekilde özetlenebilir:
Matriks olarak kullanılan Sepharose-4B CNBr ile aktifleştirildi ve uzantı kolu kullanmadan doğrudan ligand olarak 4-(6-amino- hekziloksi)-benzensülfonamid kullanıldı ve Sepharose-4B-4-(6- amino-hekziloksi)-benzensülfonamid afinite jeli sentezlendi.
Yapılan denemeler sonunda, CA-I izoenzimi için % 81.3 kolon veriminin yanında 65.1 kat saflaştırma derecesi ile CA-II izoenzimi için ise, % 97.8 kolon veriminin yanında 97.8 kat saflaştırma derecesi elde edilmiştir.
CA-I ve hCA-II izoenzimlerinin, tarafımızdan sentezlenen afinite jeline optimum tutunma bazik pH derecesinde (pH:8.5) gerçekleştiği sonucunu ortaya koymuştur.
CA-I ve CA-II izoenzimlerinin afinite kolonuna maksimum tutunma sıcaklıklarının 25o
C ve I = 0.1 iyonik şiddette gerçekleştiği saptanmıştır.
CA-I izoenzinin sentezlenen afinite jelinden elüsyonu için, en uygun tampon çözeltilerin 50 mM Na2HPO4 / 1 M NaCl, (pH:6.3), CA-II
izoenzimi için ise, 50 mM Na2HPO4/0.2 M KSCN (pH: 6.3), olarak
tespit edilmiştir.
Optimum şartlarda afinite kolonundan elüe edilen CA-I ve CA-II izoenzimlerinin saflığının kontrolü, SDS-PAGE elektroforeziyle kontrol edilmiş ve her iki izoenzim tek bant olarak tespit edilmiştirler.
46
5. KAYNAKLAR
[1] Voet, Donald., Voet, Judith G., Pratt, Charlotte W., ‘‘Fundamentals of Biochemistry’’, JohnWiley & Sons, Inc., USA, (1999).
[2] Keha, E., Küfrevioğlu, Ö.İ., ‘‘Biyokimya’’, ISBN: 975-6755-20-02, Bölüm 6 Erzurum, (2000).
[3] Onat, T., Emerk, K., ‘‘Temel Biyokimya’’, İzmir: Saray Medikal Yayıncılık, s:269-284, (1997).
[4] Alver, A., ‘‘Belirli yaş gruplarındaki sağlıklı bireylerde serum total karbonik anhidraz ve karbonik anhidraz aktivitelerinin belirlenmesi’’, Y. Lisans Tezi,
Karadeniz Teknik Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstütüsü, Trabzon, (1997).
[5] Maren, T. H. and Janskowska, L., “Ocular pharmacology of sulfonamides: The cornea as barrier and depot”. Cur.Eye. Res., 4, 399. (1985)
[6] Fresht A., Structure and mechanism in protein science, New York: W.H. Freeman Company, (1999).
[7] Nelson, D. ve Cox, M., ‘‘Lehninger Biyokimyanın İlkeleri’’, Üçüncü Baskıdan Çeviri, Palme Yayıncılık, 1152 s. (2005).
[8] Keha E., Küfrevioğlu Ö. İ., Biyokimya, Erzurum: Aktif yayınları, (2004). [9] Devlin, T.M., Biochemistry with clinical correlations, 5th Ed., Newyork:
Wiley-Liss inc., (2002).
[10] Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M., Principles of Biochemistry, 3. Baskıdan çeviri (Çeviri editörü: Kılıç N.), Palme Yayıncılık, (2005).
[11] Supuran, C.T., and Scozzafava, A., ‘‘Carbonic Anhydrase Inhibitors’’, Curr.
47
[12] Puskas, L.G., Inuni M., Zahn, K., Yukawa, H., ‘‘A periplasmic, alpha-type carbonic anhydrase from Rhodopseudomonas palustris is essential for bicarbonate uptake’’, Microbiology, 146, 2957-66, (2000).
[13] Gilmour, K.M., Perry, S.F., ‘‘Carbonic anhydrase and acid-base regulation in fish’’, J. Exp. Biol., 212; 1647-1661, (2009).
[14] Nuti, E., Orlandini, E., Nencetti, S., Rossello, A., Innocenti, A., Scozzafava, A., Supuran, C.T., "Carbonic Anhydrase and Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Inhibition of Human Tumor-Associated Isozymes IX and Cytosolic Isozyme I and II with Sulfonylated Hydroxamates", Bioorganic &
Medicinal Chemistry, 15, 2298, (2007).
[15] Şahin, A. ‘‘Bazı Karbonik Anhidraz İzoenzimlerinin Saflaştırılması İçin Yeni Bir Afinite Jelinin Sentezi ve Uygulanması’’, Yüksek LisansTezi, Balıkesir
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilimdalı, (2008).
[16] Del Prete, S., Vullo, D., Fisher, G.M., Andrews, K.T., Poulsen, S.A., Capasso, C., et al., ‘‘Discovery of a new family of carbonic anhydrase in the malaria pathogen Plasmodium falciparum the eta-carbonic anhydrases’’,
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 24, 4389-96, (2014).
[17] McDevitt, M.E., Lambert. L.A., ‘‘Molecular evolution and selection pressure in alpha-classcarbonic anhydrase family members’’, Biochimica Et
Biophysica Acta, 61,1814-1854, (2011).
[18] Claudiu T. Supuran , “Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators” Nature Reviews Drug Discovery.7, 1-14, February, (2008).
[19] Alterio, V., Di Fiore, A., Ambrosio. K., Supuran, C.T., De Simone, G., ‘‘Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrase: how to desing specific drugs targeting 15 different isoforms’’, Chemical reviews, 112, 4421, 68, (2012).
[20] Claudiu T. Supuran, Jean-Yves Winum “Drug Design of Zinc-Enzyme Inhibitors: Functional, Structural, and Disease Applications”, JohnWiley &
48
[21] Wistrand, P.J., “The importance of Carbonic Anhydrase B and C for the unloading of CO2 by the human erythrocyte”, Acta Phisiol. Scand., 343, (1981).
[22] Chegwidden, W. R., Dodgson, S. J., and Spencer, I. M., “In the Carbonic Anhydrase New Horizons”, Basel: Birkhauser Verlag, 343, (2000).
[23] Maren, T. H., “Carbonic anhydrase; chemistry, phsiology and inhibition”,
Phsiol. Rev., 47, 595, (1967).
[24] Hilvo, M., “Expression studies on carbonic anhydrase IX”, Master’s thesis,
Institute of Medical Technology, University of Tampere, (2005).
[25] Leppilampi, M., “Functional and immunohistological studies on cancer
associated carbonic anhydrase IX”, Master’s thesis, Faculty of Medicine,
University of Oulu, (2006).
[26] Lowe, N., Edwards, Y.H., Edwards, M., Butterworth, P.H., "Physical Mapping of the Human Carbonic Anhydrase Gene Cluster on Chromosome 8", Genomics, 10, (4), 882, (1991).
[27] Sowden, J., Edwards, M., Morrison, K., Butterworth, P.H.W., Edwards, Y.H., "Erythroid Expression and DNAase-Hypersensitive Sites of the Carbonic Anhydrase 1 Gene", Biochem. J., , 288, (2), 545, (1992).
[28] Kim, G., Selengut, J., and Levine, R.L., ‘‘Carbonic anhydrase III: The Phosphatase activity is extrinsic’’, Archives of Biochemistry and Biophysics, 377, 334–340, (2000).
[29] Özensoy, Ö., “Eritrositlerden Karbonik Anhidraz İzoenzimlerinin Saflaştırılması için Yeni Bir Afinite Jelinin Sentezi ve Uygulanması” Yüksek LisansTezi, Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilimdalı, (2002).
[30] Falkbring, S. O., Göthe, P. O., Nyman, L., and Parath, J., “Affinity Chromatography of carbonic anhydrase”, FEBBS. Letter, 24, 229, (1972). [31] Whitney, P. I., “Affinity Chromatography of Carbonic anhydrase”, Anal.
49
[32] Kerry, S., “Prokaryotic carbonic anhydrase”, FEMS Microbiology Reviews, 24, 335, 66, (2000).
[33] Supuran, C. T., Scozzafava, A., Conway,J., “Carbonic Anhydrase: Its Inhibitors and Activators” (Taylor & Francis Medicinal Chemistry Series),
CRC Press LLC Florida, USA, (2004).
[34] J. V. Moroney, ‘’’Carbonic Anhydrases in Plants and Algae Plant’’, Cell and Environment, 24, 141, 53, (2001).
[35] Hiroaki Takeuchi, Claudiu T. Supuran, Saburo Onishi and Isao Nishimori, “The α and β Classes Carbonic Anhydrases from Helicobacter pylori as Novel Drug Targets’’, Curr Pharm Des;14(7):622-30. (2008).
[36] Del Prete, S., Işık, S., Vullo, D., De Luca, V., Carginale, V., Scozzafava, A., et al., ‘‘DNA Cloning, Characterization and Inhibition Studies of an alpha- Carbonic Anhydrase from the Pathogenic Bacterium Vibrio cholerae’’,
Journal of Medicinal Chemistry, 55, 10742, 8, (2012).
[37] Kerry, S., Smith, C.J., Thomas, S. And James, G. F., “Carbonic anhydrase is an Ancient Enzyme Widespread in Prokaryotes”, Proceedings of the National
Academy of Sciences, 96, 15184, 9, (1999).
[38] Tripp, B.C., Smith, K., Ferry, J.G. ‘‘Carbonic anhydrase: New insights for an ancient enzyme’’ The Journal of Biological Chemistry, 276, 48615-48618, (2001).
[39] Hewitson, K.S., Vullo, D., Scozzafa, A., Mastrolorenzo, A., Supuran, C.T., ‘‘Molecular Cloning, Characterization and Inhibition Studies of a beta- Carbonic anhydrase from Malassezia globosa, a Potential Antidandruff Target’’, Journal of Medicinal Chemistry, 55, 3513, 20, (2012).
[40] Iverson, T.M., Alber, B.E., Kisker, C., Ferry, J.G., and Rees,D.C., “A Closer Look at the Active Site of γ-Class Carbonic Anhydrases: High-Resolution Crystallographic Studies of the Carbonic Anhydrase from Methanosarcina
50
[41] Kisker, C., Schindelin, H., Alber, B.E., Ferry, J.G., and Rees, D.C., “A left- handed beta-helix revealed by the crystal structure of a carbonic anhydrase from the archaeon Methanosarcina thermophila”. EMBO J. 15: 2323–2330. (1996).
[42] Del Prete, S., Vullo, D., Scozzafa, A., Capasso, C., Supuran, C.T., ‘‘Cloning, Characterization and Anion Inhibition Study of the Delta-Class Carbonic Anhydrase (TweCA) from the Marine Diatom Thalassiosira Weissflogii’’,
Bioorganic and Medicinal Chemistry, 22, 531, 7, (2014).
[43] Supuran, C.T., Scozzafava, A., ‘‘Carbonic anhydrase as targets for medicinal chemistry’’, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15, 4336-4350, (2007). [44] Alterio, V., Langella, E., Viparelli, F., Vullo, D., Ascione, G., Dathan, N.A.,
et al., ‘‘Structural and Inhibition Insights into Carbonic Anhydrase CDCA1 from the Marine Diatom Thalassiosira Weissflogii’’, Biochimie, 94, 1232, 41, (2012).
[45] Sawaya, M.R., Cannon, G., Heinhorst, S., Tanaka, S., Williams, E.B., Yeates, T.O., Kerfeld, C.A., ‘‘The structure of β-carbonicanhydrase from the carboxysomal shell reveals a distinct subclass with one active site for the price of two’’, The Journal of Biological Chemistry, 281, 7546-7555, (2006). [46] Vullo, D., Del Prete, S., Fisher, G.M., Andrews, K.T., Poulsen, S.A.,
Capasso, C., et al., ‘‘Sulfonamide Inhıbition Studies of the eta-class Carbonic Anhydrase from the Malaria Pathogen Plasmodium falciparum’’, Bioorganic
and Medicinal Chemistry, 23, 526, 31, (2015).
[47] Supuran, C.T., Ilies, M. and Scozzafava, A., ‘‘Carbonic Anhydrase Inhibitors – Part 291 : Interaction of isoenzymes I, II and IV with benzolamide-likke derivaties’’, Eur .J. Med. Chem., 33, 739-751, (1998).
[48] Chegwidden, W.R., Edwards, Y.,Carter, N., ‘‘The carbonic anhydrases-new horizons. molecular bases of inherited disease’’, 8th Ed., NewYork: McGraw- Hill Inc., 2165–2204, (2000).
51
[49] Renzi, G., Scozzafava, A. and Supuran, C. T., ‘‘Carbonic anhydrase Inhibitors: Topical Sulfonamide Antiglaucoma Agents Incoparating Secondary Amine Moieties’’, Bioorg. Med. Chem., 10, 673-676, (2000). [50] Parkkila, A.K., Scarim, A.L., Parkkila, S., Waheed, A., Corbett, J.A. and Sly,
W.S., ‘‘Expression of carbonic anhydrase V in pancreatic beta cells suggests role for mitochondrial carbonic anhydrase in insulin secretion’’, Journal of
Biological Chemistry, 273, 24620-24623, (1998).
[51] Sly, W.S. and Hu, P.Y., ‘‘Human carbonic anhydrase and carbonic anhydrase deficiencies’’, Annu. Rev. Biochem., 67, 375-401, (1995).
[52] Arslan, O., ‘‘Glaucoma Tedavisinde Kullanılmaya Aday Karbonik Anhidrazm İnhibitörlerinin Sentezi ve İnhibisyon Etkilerinin Araştırılması’’, Doktora Tezi, Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Erzurum, (1994).
[53] Tang, Y., Xu, H., Du, X., Lit, L., Walker, W., Lu, A., et al., ‘‘Gene Expression in Blood Changes Rapidly in Neutrophils and Monocytes after Ischemic Stroke in humans: a Microarray Study’’, Journal of cerebral blood
flow and metabolism : official journal of Medicinal Chemistry, 50, 381, 8,
(2007).
[54] Isao, N., Saburo, O., Daniela, V., Scozzafava, A., and Supuran, C. T., ‘‘Carbonic anhydrase Inhibitors. DNA Cloning, Characterization, and Inhibition Studies of the Human Secretory Isoform VI, a New Target for Sulfonamide and Sulfamate Inhibitors’’, Journal of Medicinal Chemistry, 50, 381, 8, (2007).
[55] Supuran, C.T., ‘‘Carbonic anhydrases: Novel Therapeutic Applications for Inhibitors and Activators”, Nature reviews Drug Discovery, 7, 168, 81, (2008).
[56] Pocker, Y. and Janjic, N., ‘‘Molecularity of Water in Enzymic Catalysis. Application to Carbonic anhydrase II’’, J. Am. Chem. Soc., 111, 731, (1989).
52
[57] Briganti, F., Pierattelli, A, Scozzafava, A. and Supuran, C. T., “Carbonic anhydrase inhibitors. Part 37. Novel classes of isozyme I and II inhibitors and their mechanism of action. Kinetic and spectroscopic investigations on native and cobalt-substituted enzymes. Eur. J. Med. Chem., 31, 1001, (1996). [58] Cuatracasas, P., “Protein Purification by Affinity Chromatography,
derivatizations of agaroze and polyacrylamide beads”, J. Biol. Chem., 245, 3059, (1970).
[59] Arslan, O., Nalbantoglu, B., Demir, N., Özdemir, H., Küfrevioglu, Ö.İ., “A new Method for the purification of Carbonic Anhydrase Isozymes by Affinity Chromatography” Turkish Journal of Medical Sciences, 26, 163-166, (1996). [60] Warburg, O., and Christian, W., “Isolierung und Kristallization des
Gärungsferments Enolase”, Biochem., 310, 384, (1941).
[61] Bradford, M. M., “A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram quantites of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,
Anal. Biochem., 72, 248, (1976).
[62] Wilbur K. M., Anderson N.G., ‘‘Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase’’, Journal of Biological Chemistry, 176, 147-154, (1948).
[63] Maren, C. H., “A simplified micromethod fort he determination of carbonic anhydrase and its inhibitors”. J. Pharmac. Exp. Ther., 130, 26 p., (1960). [64] Laemelli, D. K., “Cleavege of structural ptoteins during in assembly of the
head of bacteriophage T4”, Nature, 227-680, (1970).
[65] Kılınç N.,. ‘‘Karbonik anhidraz I ve II izoenzimlerinin koyun midesinden saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı ilaçların enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi’’, Yüksek Lisans Tezi, Atatürk Üniversitesi Fen
53
[66] Bozdag, M., Pinard, M., Carta, F., Masini, E., Scozzafava, A., McKenna, R., and Supuran, C.T., “A Class of 4-Sulfamoylphenyl-ω-aminoalkyl Ethers with Effective Carbonic Anhydrase Inhibitory Action and Antiglaucoma Effects” J. Med. Chem., 57 (22), 9673–9686, (2014).
[67] Bozdag, M.,, Isik, S., Beyaztas, S., Arslan, O., and Supuran C.T.. “Synthesis of a novel affinity gel for the purification of carbonic anhydrases.” Journal Of
Enzyme Inhibition And Medicınal Chemistry, 30 (2), 240-244 (2015).
[68] Sahin, A., Isık, S., Arslan, O., Supuran, C.T., and Ozensoy Guler, O. “A new affinity gel for the purification of alpha-carbonic anhdrases.” Journal Of