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A maior parte das substâncias húmicas presentes no solo e em sedimentos é encontrada na forma insolúvel, podendo se apresentar como complexos macromoleculares insolúveis, complexos macromoleculares ligados a cátions di ou tri-valentes (p. ex: Ca2+, Fe3+ e Al3+) ou combinados com argilas minerais, formando pontes do tipo argila-metal-humus ou outros tipos de ligação (pontes de hidrogênio, interações de Van der Waals). A forma predominantemente encontrada dependerá do tipo de solo. Nos solos ricos em matéria orgânica, as baixas quantidades de argila e metais resultam na presença de complexos macromoleculares insolúveis. Em solos com elevados teores de argila mineral, a presença de camadas superficiais contendo óxidos hidratados facilita a predominância de complexos insolúveis ligados a metais. O método a ser escolhido para a extração das substâncias húmicas deve, portanto, considerar a forma como a matéria orgânica se encontra ligada ao solo, de forma a permitir sua separação da “solução” do solo (STEVENSON, 1985).

Uma desvantagem no estudo das substâncias húmicas é que os métodos de extração citados na literatura causam alguma alteração dos compostos originais e, dessa forma, os produtos obtidos não serão exatamente aqueles encontrados no ambiente natural (PEURAVUORI, 1992; THURMAN et al. 1988).

Em princípio, o método mais apropriado para a extração das substâncias húmicas deve fornecer material representativo das frações presentes no solo, com menor alteração possível e livre de contaminantes inorgânicos, tais como argila e cátions polivalentes. O solvente utilizado deve ser altamente polar, com elevada constante dielétrica e pequena massa molecular, de modo a penetrar mais facilmente na estrutura dos húmicos, sendo capaz de romper ligações de hidrogênio existentes e permitir a formação de ligações entre as moléculas húmicas e o

solvente. As primeiras tentativas de extração das substâncias húmicas do solo, feitas por ACHARD (1786), utilizavam substâncias alcalinas. No entanto, diversas outras substâncias têm sido utilizadas, tais como soluções diluídas de etilenodiamina (EDA), pirofosfato de sódio (Na2P2O7), dimetilformamida (DMF), ácido

etilenodiaminatetracético (EDTA) ou dimetilsulfóxido (DMS). A seleção de qual destas substâncias será mais apropriada para a extração das substâncias húmicas deve considerar o tipo predominante de associações do material no solo. Para substâncias húmicas ligadas a cátions polivalentes, por exemplo, é melhor proceder a extração utilizando agentes quelantes, como Na2P2O7. Para a extração de material

húmico fortemente ligado a argila, métodos mais drásticos, utilizando soluções alcalinas, costumam ser utilizados.

O sedimento estuarino utilizado para a extração das substâncias húmicas continha elevados teores de argila. Assim, com base nos dados de literatura (HAYES, 1985; PARSONS, 1988; ROSA, 1998; STEVENSON, 1985), os quais indicam soluções alcalinas diluídas como quantitativamente mais eficientes na extração de matéria orgânica intimamente ligada a argila, a extração das substâncias foi feita com solução de NaOH 0,5 mol/L. Para evitar oxidação da matéria orgânica em condições moderadamente alcalinas, a extração foi feita sob atmosfera de nitrogênio.

A separação dos ácidos húmicos e fúlvicos presentes no extrato alcalino foi feita por acidificação com solução de HCl 6,0 mol/L e, desta forma, a fração de ácidos húmicos que, por definição, precipita em meio suficientemente ácido (pH 2,0) foi separada dos ácidos fúlvicos sendo, em seguida, centrifugada e novamente solubilizada em solução diluída de NH4OH.

Após a extração, vários constituintes orgânicos ou inorgânicos podem ainda estar fisicamente ligados ao material húmico extraído (por exemplo: sais, metais, lipídios, polissacarídeos, aminoácidos etc.). Além disso, a extração feita com solução de hidróxido de sódio, com posterior acidificação utilizando solução de ácido clorídrico e redissolução em solução de hidróxido de amônio, resulta em elevadas quantidades de cloreto de sódio e amônio acrescentadas ao material húmico. Para minimização desses interferentes, resinas trocadoras ou diálise têm sido frequentemente utilizadas (TOSCANO, 1999). Para eliminação parcial das interferências foi feita a purificação através de sucessivos tratamentos com resinas de troca iônica. As resinas utilizadas, IRA-400 (aniônica) e Dowex 50W-X8 (catiônica), são reconhecidas pela elevada capacidade de troca (1,4 e 1,7 meq/mL em resina úmida, respectivamente) e pelo amplo intervalo de pH em que podem ser utilizadas (dados informados pelo fornecedor). Tais resinas eliminaram os sais de cloreto presentes nos ácidos húmicos, sendo comprovada a ausência por testes feitos com solução de AgNO3 nas soluções eluídas das colunas de troca iônica.

A relação ácidos húmicos/ácidos fúlvicos pode apresentar valores que variam entre 0,3 e 2,5, de acordo com o tipo e com a profundidade no perfil do solo. Foi observado, por exemplo, que em solos de floresta os ácidos fúlvicos são a fração predominante, enquanto que em solos de turfas e gramados os ácidos húmicos predominam (STEVENSON, 1985).

O material húmico extraído da amostra de sedimento estuarino apresentou fração de ácidos fúlvicos bem superior à dos ácidos húmicos. Para 20 g de sedimento seco, as quantidades obtidas após liofilização foram de 4,31 g de ácidos fúlvicos e 1,05 g de ácidos húmicos, com uma razão ácidos húmicos/ácidos fúlvicos de 0,24. Vários fatores podem ter contribuído para a baixa razão obtida.

Uma primeira questão a considerar é que as quantidades obtidas para cada fração de material húmico foram baixas. Provavelmente, as sucessivas etapas de purificação devem ter causado perdas significativas do material húmico. Particularmente, os ácidos húmicos apresentaram uma forte adsorção nas resinas trocadoras, tendo sido necessário lavar as resinas diversas vezes com água deionizada.

Também, a fração “humina”, a qual não é extraída pela solução alcalina, frequentemente contem ácidos húmicos intimamente ligados a parte mineral do solo, não chegando a ser separados durante o processo de extração do material húmico. Na fração humina pode estar também presente material húmico altamente condensado e, portanto, insolúvel em soluções alcalinas. A perda desse material durante o processo de extração do sedimento deve ter igualmente contribuído para a baixa quantidade extraída de ácidos húmicos.

Em uma mesma região, as substâncias húmicas extraídas de diferentes ambientes costumam ser, em alguns aspectos, similares entre si (STEVENSON, 1985; THURMAN, 1985). Assim, os ácidos húmicos e fúlvicos extraídos das águas do córrego Itapitangui, localizado na bacia 34 – Ribeira do Iguape, local próximo ao da coleta de sedimento, apresentou relação ácidos húmicos/ácidos fúlvicos de 0,29, valor que se aproxima ao observado para o sedimento estuarino (TOSCANO, 1999).

A eficiência no processo de extração e purificação dos ácidos húmicos foi avaliada pelo teor de cinzas do material extraído (BENEDETTI et al., 1996; HUFFMAN & STUBER, 1985; WERSHAW, 1986). Para os ácidos húmicos, o teor de cinzas obtido foi de 5,33%. O elevado valor foi atribuído a presença de sílica no sedimento estuarino, assim como outras possíveis impurezas inorgânicas.

4.2- Caracterização dos ácidos húmicos