FMN2 İmmunofloresan Analizi Bulguları

Immunofloresan deneyleri ile FMN2’nin kontrol grubunda GV aşamadan PBE aşamasına kadar tüm maturasyon evrelerinde oosit sitoplazmasında lokalize olduğu görülmüştür. FMN2 floresan yoğunluğunun GVBD aşamada GV’ye göre anlamlı şekilde fazla olduğu belirlenmiştir. İğ oluşumu aşamasında FMN2’nin floresan yoğunluğunun GVBD’ye göre azaldığı ve özellikle iğ çevresinde lokalize olduğu görülmüştür. FMN2, iğ göçü ve PBE aşamasında hem iğ çevresindeki sitoplazmik alanlarda hem de kortikal alanlarda lokalizasyon göstermektedir ve floresan yoğunluğu iğ oluşumu aşamasına göre daha fazladır (Şekil 4.3).

Şekil 4.3. In vitro maturasyon uygulanan kontrol grubu oositlerde FMN2 immunolokalizasyonu. A) GV (a), GVBD (b), iğ oluşumu (c), iğ göçü (d) ve PBE (e) aşamadaki oositler, negatif kontrol (f). Bar: 20 μm. Yeşil: FMN2. Kırmızı (korteks): F-Aktin. Kırmızı (iğ): a-tubulin. Mavi: Dapi. B) Oositteki FMN2 immünboyanmalarının Image J analizinden elde edilen matematiksel değerlerin grafiği. Farklı harfler istatistiksel anlamlılığı ifade etmektedir (p < 0.05) (One way anova, Holm Sidak yöntemi). Tüm gruplar birbirleri arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmış, anlamlı fark olan gruplara ait sütunlara farklı harfler verilmiş, fark görülmeyen gruplara ait sütunlar aynı harf ile işaretlenmiştir. Grafikteki değerler 3 farklı deney sonucunda elde edilen verilerin ortalamasını yansıtmaktadır.

B

b

c

_c

c

A

56 IVM süresince PD98059 ile MEK inhibisyonu yapıldığında, FMN2 floresan yoğunluğunun en fazla GVBD aşamada olduğu belirlenmiştir. İğ oluşumu ve iğ göçü aşamalarında FMN2 floresan yoğunluğu GVBD’ye göre azalmıştır. İğ oluşumu aşamasında iğ çevresinde spesifik bir FMN2 lokalizasyonu görülmemiş, kortikal alanlarda lokalizasyon saptanmıştır. İğ göçü sırasında FMN2’nin hem iğ çevresi hem de kortekste lokalize olduğu, PBE aşamasında FMN2 floresan yoğunluğunun anlamlı şekilde azaldığı görülmüştür (Şekil 4.4).

Şekil 4.4. In vitro maturasyon uygulanan PD98059 (MEK inhibisyon) grubu oositlerde FMN2 immunolokalizasyonu. A) GV (a), GVBD (b), iğ oluşumu (c), iğ göçü (d) ve PBE (e) aşamadaki oositler, negatif kontrol (f). Bar: 20 μm. Yeşil: FMN2. Kırmızı (korteks): F-Aktin. Kırmızı (iğ): a- tubulin. Mavi: Dapi. B) Oositteki FMN2 immünboyanmalarının Image J analizinden elde edilen matematiksel değerlerin grafiği. Farklı harfler istatistiksel anlamlılığı ifade etmektedir (p < 0.05) (One way anova, Holm Sidak yöntemi). Tüm gruplar birbirleri arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmış, anlamlı fark olan gruplara ait sütunlara farklı harfler verilmiş, fark görülmeyen gruplara ait sütunlar aynı harf ile işaretlenmiştir. Grafikteki değerler 3 farklı deney sonucunda elde edilen verilerin ortalamasını yansıtmaktadır.

B

a

ab

b

b

c

A

57 H89 uygulaması ile MPF aktive edildiğinde, GV aşamada düşük olan FMN2 floresan yoğunluğunun, GVBD oositlerde diğer aşamalara göre anlamlı şekilde daha fazla olduğu belirlenmiştir. İğ oluşumu aşamasında FMN2 yoğunluğu GVBD’ye göre azalmıştır ve FMN2 lokalizasyonunun iğ çevresinde olduğu görülmüştür. H89 uygulamasının özellikle iğ göçü aşamasında FMN2 yoğunluğunu azalttığı belirlenmiştir. PBE aşamasında hem iğ çevresinde hem de kortekste lokalize olan FMN2’nin floresan yoğunluğunun GVBD’ye göre düşük olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.5).

Şekil 4.5. In vitro maturasyon uygulanan H89 (MPF aktivasyon) grubu oositlerde FMN2 immunolokalizasyonu. A) GV (a), GVBD (b), iğ oluşumu (c), iğ göçü (d) ve PBE (e) aşamadaki oositler, negatif kontrol (f). Bar: 20 μm. Yeşil: FMN2. Kırmızı (korteks): F-Aktin. Kırmızı (iğ): a- tubulin. Mavi: Dapi. B) Oositteki FMN2 immünboyanmalarının Image J analizinden elde edilen matematiksel değerlerin grafiği. Farklı harfler istatistiksel anlamlılığı ifade etmektedir (p < 0.05) (One way anova, Holm Sidak yöntemi). Tüm gruplar birbirleri arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmış, anlamlı fark olan gruplara ait sütunlara farklı harfler verilmiş, fark görülmeyen gruplara ait sütunlar aynı harf ile işaretlenmiştir. Grafikteki değerler 3 farklı deney sonucunda elde edilen verilerin ortalamasını yansıtmaktadır.

B

a

b

ab

b

c

A

58 IVM sırasında hem PD98059 hem de H89 uygulandığında, diğer deney gruplarında olduğu gibi GVBD aşamadaki oositlerde FMN2 floresan yoğunluğunun GV’ye oranla arttığı görülmüştür. İğ oluşumu aşamasında iğ çevresinde FMN2 lokalizasyonu görülürken, iğ göçü aşamasında FMN2 floresan yoğunluğunda azalma olduğu belirlenmiştir. PBE aşamasında ise iğ çevresinde yoğunlaşmaksızın sitoplazmik ve kortikal alanlarda lokalize olan FMN2’nin floresan yoğunluğunda GV, iğ oluşumu ve iğ göçü aşamalarına göre anlamlı düzeyde artış görülmüştür (Şekil 4.6).

Şekil 4.6. In vitro maturasyon uygulanan PD98059+H89 grubu oositlerde FMN2 immunolokalizasyonu. A) GV (a), GVBD (b), iğ oluşumu (c), iğ göçü (d) ve PBE (e) aşamadaki oositler, negatif kontrol (f). Bar: 20 μm. Yeşil: FMN2. Kırmızı (korteks): F-Aktin. Kırmızı (iğ): a- tubulin. Mavi: Dapi. B) Oositteki FMN2 immünboyanmalarının Image J analizinden elde edilen matematiksel değerlerin grafiği. Farklı harfler istatistiksel anlamlılığı ifade etmektedir (p < 0.05) (One way anova, Holm Sidak yöntemi). Tüm gruplar birbirleri arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmış, anlamlı fark olan gruplara ait sütunlara farklı harfler verilmiş, fark görülmeyen gruplara ait sütunlar aynı harf ile işaretlenmiştir. Grafikteki değerler 3 farklı deney sonucunda elde edilen verilerin ortalamasını yansıtmaktadır.

B

a

ab

b

c

c

A

59 FMN2 floresan yoğunluğu verileri farklı deney grupları arasında oosit maturasyonunun belirli aşamalarında değerlendirildiğinde GVBD aşamada PD98059 ve PD98059+H89 gruplarında FMN2 seviyesinde düşüş olduğu belirlenmiştir. İğ oluşumu aşamasında FMN2 floresan yoğunluğu kontrol grubunda diğer gruplara göre yüksektir. İğ göçü aşamasında PD98059 grubunda kontrol grubuna göre düşük olan FMN2 yoğunluğunun H89 ve PD98059+H89 grubunda daha da düştüğü görülmektedir. PBE aşamasında ise FMN2 yoğunluğu PD98059 uygulaması ile kontrole göre azalmış, H89 ve PD98059+H89 gruplarında ise tekrar yükseldiği görülmüştür (Şekil 4.7).

Şekil 4.7. Oosit maturasyonunun farklı aşamalarındaki FMN2 immünboyanmalarının Image J analizinden elde edilen matematiksel değerlerin grafiği. Farklı harfler istatistiksel anlamlılığı ifade etmektedir (p < 0.05) (One way anova, Holm Sidak yöntemi). Tüm gruplar birbirleri arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmış, anlamlı fark olan gruplara ait sütunlara farklı harfler verilmiş, fark görülmeyen gruplara ait sütunlar aynı harf ile işaretlenmiştir. Grafikteki değerler 3 farklı deney sonucunda elde edilen verilerin ortalamasını yansıtmaktadır.

60