İMMÜNOHİSTOKİMYASAL BULGULAR

Kontrol grubu ve immobiliza stres grubuna ait ovaryum doku kesitlerinde, foliküler farklılaşmada rol alan büyüme faktörlerinden IGF-1, AMH ve Bcl-2 için immunohistokimyasal boyamalar yapılmıştır. Üç antikora ait ovariyan immünoreaktivite değerlendirilmiş, semikantitatif olarak HSCORE yöntemi ile de boyanma şiddetleri hesaplanmıştır. Elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirilip Tablo 4’te sunulmaktadır.

Tablo 4. Kontrol ve stres gruplarına ait IGF-1, AMH ve Bcl-2 için HSCORE değerlerinin karşılaştırılması

Kontrol Grubu (n=8) Stres Grubu (n=8) p IGF-1 HSCORE 215,63 ± 21,3 128,75 ± 13,6 <0,0001* AMH HSCORE 233,75 ± 13 143, 75 ± 22,6 <0,0001* Bcl-2 HSCORE 142,50± 14,9 106,25 ± 14,1 <0,0001*

*: Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, p<0,0001.

IGF-1 İmmünoreaktivite Değerlendirmesi

Kontrol grubu ovaryum kesitlerinde, sitoplazmik IGF-1 immünoreaktivitesi farklı gelişim aşamasındaki tüm sağlıklı foliküllerde gözlenmiştir. Stromada ve korpus luteumlarda ise herhangi bir immünoreaktivite saptanmamıştır (Şekil 46). En şiddetli boyanmalar multilaminar primer ve sekonder aşamadaki foliküllerin granüloza hücrelerinde ve oositlerinde tespit edilmiştir. Fakat teka tabakalarında immünoreaktivite oldukça zayıf izlenmektedir (Şekil 47). Germinal epitel ve interstisyel alanda da IGF-1 immün boyanması gözlenmezken (Şekil 48), atretik foliküllerde, atrezinin derecesine bağlı olarak granüloza hücrelerinin zayıf ya da negatif immün boyanma sergilediği görülmektedir (Şekil 49).

Stres grubuna ait ovaryum kesitlerinde, az sayıda IGF-1 pozitif boyanmış foliküller izlenirken, boyanma şiddetinin de zayıf olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 50). Bu grupta, sağlıklı foliküllerin granüloza hücrelerinin ve oositlerinin sitoplazmalarında, IGF-1 ifadesinin zayıf ve orta şiddette olduğu izlenirken, teka tabakası ve interstisyel alanda boyanma tespit edilmemiştir (Şekil 51). Atretik foliküllerin granüloza hücrelerinde ise IGF-1 immünoreaktivitesi negatif olarak saptanmıştır (Şekil 52).

55

Her iki grupta, her bir deneğe ait IGF-1 ile boyanmış üç ovaryum preperatı incelendiğinde stres grubu HSCORE değerinin (128,7), kontrol grubu değerinden (215,6) daha düşük olduğu ve iki skor arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlılık taşıdığı görülmüştür (p<0,0001; Tablo 4).

56

Kontrol Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 46. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, farklı gelişim aşamalarındaki çok sayıda sağlıklı folikülün granüloza hücrelerinde sitoplazmik IGF-1 immünoreaktivitesi görülmektedir. MPF: multilaminar primer folikül, GF: graaf folikülü, KL: korpus luteum. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 47. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, multilaminar primer foliküllerin (MPF) granüloza hücrelerinde (GH) ve oositlerde (*) belirgin IGF-1 immünoreaktivitesi gözlenirken, folikülleri saran teka tabakasında (T) negatif boyanma izlenmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

57

Şekil 48. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, primer folikül (PF), sekonder folikül (SF) ve graaf folikülünün (GF) granüloza hücreleri ve oositlerinde (*), orta şiddette IGF-1 immünoreaktivitesi izlenirken, interstisyel alanda (İA) boyanma gözlenmemektedir. T: teka tabakası. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

Şekil 49. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, sağlıklı foliküllerin arasında bulunan atretik foliküllerde (AF), IGF-1 immonoreaktivitesi gözlenmemektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

58

Stres Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 50. Stres grubuna ait ovaryum kesitlerinde, primer folikül (PF) ile sekonder foliküllerde (SF), hem granüloza hücreleri hem de oositlerinde (*) çok zayıf IGF-1 immünoreaktivitesi gözlenmektedir. GE: germinal epitel. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 51. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde, büyük ve küçük çaplı folikül oositleri (*) IGF-1 için orta şiddette immünoreaktivite gösterirken, granüloza hücreleri (GH) zayıf, teka tabakası (T) ise negatif boyanma sergilemektedir. İA: interstisyel alan, PF: primer folikül, SF: sekonder folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

59

Şekil 52. Stres grubuna ait ovaryum kesitleri az sayıda sağlıklı folikül içermesi ile karakterizedir. Şekildeki sağlıklı folikülde, oosit (*) boyanması belirgin iken granüloza hücreleri (GH), IGF-1 için negatif boyanma sergilemiştir. Atretik foliküllerin (AF) granüloza hücrelerinde de negatif IGF-1 immünoreaktivitesi izlenmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

60

AMH İmmünoreaktivite Değerlendirmesi

Kontrol ve stres gruplarına ait ovaryum doku örnekleri incelendiğinde, AMH immünoreaktivitesi sadece foliküllerin granüloza hücre sitoplazmalarında görülmüş olup, boyanma şiddeti HSCORE kullanılarak değerlendirilmiştir.

Kontrol grubu ovaryum kesitleri üzerinde, tüm gelişim aşamasındaki sağlıklı foliküllerde, AMH immünoreaktivitesinin olduğu, ancak germinal epitel, korpus luteum ve interstisyel bezlerde herhangi bir boyanmanın olmadığı tespit edilmiştir (Şekil 53). Primer foliküllerin ileri aşamasında ve sekonder foliküllerde, oldukça yoğun bir AMH immünoreaktivitesi izlenmiştir (Şekil 54). Dönüşüm aşamasındaki primordiyal foliküllerde ve graaf foliküllerinde zayıf/orta derecelerde AMH immünoreaktivitesi olduğu gözlenirken (Şekil 55), atretik foliküllerin çoğunda negatif boyanma tespit edilmiştir (Şekil 56).

Stres grubuna ait deneklerden alınmış ovaryum doku örnekleri incelendiğinde, pozitif boyanan folikül miktarının, kontrol grubuna kıyasla daha az olduğu gözlenmiştir. Bu gruba ait sağlıklı primer ve sekonder foliküllerde, AMH immünoreaktivitesinin orta ve zayıf şiddette olduğu tespit edilmiştir (Şekil 57). Gerek primordiyal gerekse primer aşamadaki foliküllerde, AMH immünoreaktivitesi zayıf olarak gözlenirken, multilaminar primer ve sekonder foliküllerde boyanma şiddeti, kontrol grubuna göre belirgin olarak azalmıştır (Şekil 58). Kontrol grubuna benzer şekilde stres grubunda da, ovaryumu çevreleyen germinal epitelde (Şekil 58), interstisyel bezlerde (Şekil 59) ve korpus luteumda negatif AMH immün boyanması tespit edilmiştir. Graaf foliküllerinin granüloza hücre sitoplazmalarında ise kontrol grubuna kıyasla, çok düşük şiddette AMH immünoreaktivitesi gözlenmiştir. (Şekil 60).

Her iki grupta, her deneğe ait ovaryum kesitleri incelendiğinde, stres grubunda AMH immünoreaktivitesinin kontrole kıyasla daha zayıf olduğu görülmüştür. Kontrol grubu HSCORE değeri (233,7) ile stres grubu HSCORE değeri (143,7) arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,0001; Tablo 4).

61

Kontrol Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 53. Kontrol grubu ovaryum kesitinde, başlıca granüloza hücre sitoplazmalarında olmak üzere, multilaminar primer foliküllerde (MPF) ve sekonder foliküllerde (SF) şiddetli AMH immünoreaktivitesi izlenmektedir. Foliküllerin teka tabakasında, interstisyel alan ve bezlerde (İB) ise negatif boyanma gözlenmektedir. PF: küçük çaplı primer folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 54. Kontrol grubu ovaryum kesitinde, sekonder foliküllerde (SF) şiddetli, küçük çaplı primer foliküllerde (PF) ise orta şiddette AMH immünoreaktivitesi gözlenirken, interstisyel bezlerde (İB) boyanma saptanmamıştır. MPF: multilaminar primer folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

62

Şekil 55. Kontrol grubu ovaryum kesitinde, ovariyan foliküller içerisinde en şiddetli AMH immünoreaktivitesinin gözlendiği aşama, multilaminar primer folikül (MPF) aşamasıdır. Şekildeki folikülde oosit (*) negatif boyanırken granüloza hücre boyanması oldukça şiddetli bir şekilde izlenmektedir. PF:primer folikül. İçsel şekil: Bu mikrografta zayıf/orta şiddette boyanmış graaf folikülü görülmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

Şekil 56. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, atretik foliküllerde (AF), sağlıklı foliküllere kıyasla, çok sayıda negatif AMH immünoreaktivitesi gösteren granüloza hücrelerinin (sarı ok) varlığı izlenmektedir. Ok başı: primordiyal foliküller. SF: sekonder folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

63

Stres Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 57. Stres grubu ovaryum kesitinde, primordiyal foliküllerin (ok başı) çoğunda AMH ile zayıf immün boyanma gözlenirken, küçük ve orta çaplı primer foliküller (PF) ile sekonder foliküllerde (SF) granüloza hücre sitoplazmalarında zayıf/orta AMH immünoreaktivitesi izlenmektedir. AF: atretik folikül. GF: graaf folikülü. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 58. Stres grubu ovaryum kesitinde, kontrol grubuyla benzer şekilde, germinal epitelde (GE) ve interstisyel alanda AMH boyanması görülmemektedir. Primer foliküller (PF) ve multilaminar primer foliküllerde (MPF) ise zayıf şiddette AMH immünoreaktivitesi gösterilmiştir. SF: sekonder folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

64

Şekil 59. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde, primer foliküllerde (PF), AMH için çoğunlukla negatife yakın bir immünoreaktivite gözlenirken, sekonder foliküllerin (SF) granüloza hücre (GH) sitoplazmalarında, kontrol grubuna kıyasla zayıf bir boyanma şiddeti olduğu izlenmektedir. Ayrıca oosit (*), teka tabakası (T) ve interstisyel bezlerde (İB) AMH immünoreaktivitesinin negatif olduğu görülmüştür. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

Şekil 60. Stres grubu ovaryum kesitinde, graaf folikülü (GF) granüloza hücrelerinde (GH), sekonder foliküllere (SF) kıyasla oldukça zayıf bir AMH immünoreaktivitesi olduğu görülmektedir. *: oosit. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

65

Bcl-2 İmmünorektivite Değerlendirmesi

Kontrol grubu ovaryum doku örneklerinde, başta foliküller olmak üzere germinal epitel, interstisyel bezler ve korpus luteumda da sitoplazmik Bcl-2 boyanmasının belirgin seviyede olduğu gözlenmiştir (Şekil 61). Primordiyal foliküllerin foliküler hücreleri ile oositlerinde orta şiddette boyanma gözlenirken (Şekil 62), başlıca multilaminar ve sekonder foliküllerin oositlerinde şiddetli, granüloza ve teka hücrelerinde ise orta şiddette Bcl-2 immünoreaktivitesinin olduğu tespit edilmiştir (Şekil 63). Atrezinin derecesine bağlı olarak, atretik foliküllerde zayıf/negatif boyanma saptanmıştır (Şekil 63). Ayrıca bu grupta, korpus luteumlarda orta, interstisyel bezlerde ise orta/şiddetli immün boyanma olduğu görülmüştür (Şekil 64).

Stres grubundaki deneklerden alınan ovaryum kesitleri incelendiğinde, Bcl-2 immünoreaktivitesinin orta ve zayıf şiddette olduğu saptanmıştır (Şekil 65). Germinal epitel, interstisyel bezler ve korpus luteumlarda Bcl-2 immünoreaktivitesinin oldukça zayıf olduğu izlenmiştir. Ayrıca bu gruba ait ovaryum kesitlerinde, fazla sayıda gözlenen atretik foliküller, Bcl-2 için negatif boyanma sergilemektedir (Şekil 65,66). Primordiyal ve primer foliküllerin foliküler hücreleri zayıf şiddette boyanırken, oositlerde Bcl-2 boyanması orta şiddette gözlemlenmiştir (Şekil 67). Sekonder ve graaf foliküllerinde de hem oosit hem de granüloza hücrelerinde, Bcl-2 ifadesi zayıf şiddette tespit edilmiştir (Şekil 68).

Her deneğe ait Bcl-2 immün boyanması yapılmış ovaryum kesitleri incelendiğinde, stres grubunda boyanma şiddetinin kontrole kıyasla daha zayıf olduğu görülmüştür. Kontrol grubu HSCORE değeri (142,5) ile stres grubu HSCORE değeri (106,2) arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0,0001; Tablo 4).

66

Kontrol Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 61. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, sağlıklı primer foliküller (PF), sekonder foliküller (SF) ve graaf folikülünde (GF) ayrıca, interstisyel bezlerde (İB) pozitif Bcl-2 immünoreaktivitesi izlenmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 62. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitinde, ovaryumu saran germinal epitel (GE) ve ovariyan kortekste bulunan sağlıklı primordiyal foliküllerde (ok başı) orta şiddetli Bcl-2 immünoreaktivitesi gösterilmiştir. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

67

Sekil 63. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitlerinde, multilaminar primer folikül (MPF) ve sekonder foliküllerin (SF), granüloza hücrelerinde (GH) orta, oositlerinde (*) ise şiddetli Bcl-2 immünoreaktivitesi görülmektedir. T: teka tabakası, İB: interstisyel bezler, İçsel şekil: Atretik foliküllerde (AF) sağlıklı foliküllere göre Bcl-2 boyanma şiddeti oldukça zayıftır. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

Şekil 64. Kontrol grubuna ait ovaryum kesitlerinde, primordiyal foliküllerde (ok başı), primer foliküllerde (PF) ve korpus luteumlarda (KL) orta şiddetli, interstisyel bezlerde (İB) ise şiddetli Bcl-2 immünoreaktivitesi görülmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

68

Stres Grubu Ovaryum Kesitleri

Şekil 65. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde gözlenen az sayıda sağlıklı foliküllerde, Bcl-2 immünoreaktivitesi zayıf şiddette iken, atretik foliküller (AF) negatif boyanmıştır. Germinal epitel (GE) ve interstisyel bezlerde (İB) Bcl-2 zayıf şiddette izlenmektedir. SF: sekonder folikül. Hematoksilen zıt boyaması, X100.

Şekil 66. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde, korpus luteumda (KL) zayıf şiddette Bcl-2 immünoreaktivitesi var iken, atretik folikülde (AF) Bcl-2 immün boyanması gözlenmemektedir. SF: sekonder folikül. *: fragmente oosit. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

69

Şekil 67. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde, primordiyal foliküllerde (ok başı) ve primer foliküllerde (PF) zayıf şiddette Bcl-2 immünoreaktivitesi görülmektedir. Hematoksilen zıt boyaması, X400.

Şekil 68. Stres grubuna ait ovaryum kesitinde, büyük çaplı foliküllerin granüloza hücrelerinde (GH) negatife yakın, oositlerinde (*) ise orta şiddette Bcl-2 immünoreaktivitesi gözlenmiştir. PF: primer folikül, SF: sekonder folikül, T:teka tabakası. Hematoksilen zıt boyaması, X200.

70

TARTIŞMA

Günümüzde toplum yapısı, kültürü, ekonomisi ve yaşam alanlarının farklılaşması, hatta çalışma ritminin değişmesi gibi nedenlerle kadınlar üzerindeki baskı giderek artmaktadır. Bu baskı sonucu oluşan stres maruziyetinin olumsuz etkilerinden biri de üremeyle ilgili sorunlardır. Çalışmalarda gebelik oluşma süresinin uzaması ve infertilite riskinin artması, gebelik öncesi yaşanan stres ile ilişkilendirilmiştir. Kadınlarda, özellikle infertiliteye bağlı olarak yaşanan stres, üreme tedavisinin sonucuna doğrudan ya da dolaylı olarak olumsuz yönde etki edebilmektedir. Üremenin olumsuz yönde etkilenmesi, stres yaratan olaylar tarafından tetiklenebilir ve bu durum yüksek fizyolojik stres yanıtı oluşturmaya duyarlı kadınlarda daha sık gözlenebilir. Dişilerde üreme potansiyeli, ovariyan rezervin kapasitesi ile bağlantılıdır. Ovaryumda çok sayıda folikül ve sağlıklı oositlerin bulunması ise iyi bir ovariyan rezervin belirteçleri arasında düşünülmektedir. Bugüne kadar dişilerde stres bulguları üzerine çok sayıda çalışma olmakla birlikte, ovaryum dinamiğindeki değişimleri ortaya koymak için, foliküler farklılaşma ve oosit büyümesinde rol alan IGF-1, AMH ve Bcl-2 seviyeleri üzerine sınırlı sayıda çalışma mevcuttur. Çalışmamızda, kronik fizyolojik stres uygulamasının dişi erişkin ratlarda davranışsal, fizyolojik/endokrin ve ovaryum histolojisi üzerine etkilerinin ortaya konmuştur.

Kronik stresin fizyolojik etkileri arasında, ilk gözlenen değişimlerden biri ağırlık bulgularıdır. Yapılan çalışmalarda, immobilizasyon stresine maruz kalan erkek sıçanlarda, vücut ve testis ağırlığında azalma olduğu saptanmıştır (6,96). Wang ve ark. (97) üç haftalık kısıtlama stresine maruz bıraktıkları sıçanların, vücut ağırlıklarında düşüş olduğunu ileri sürmüştür. Bir diğer çalışmada, 21 gün, günde 6 saat kısıtlama stresi uygulanmış dişi sıçanlarda, stresin etkisi ve uzunluğuna bağlı olarak vücut ağırlıklarının kontrol grubuna göre anlamlı olarak azaldığı rapor

71

edilmiştir (71). Mairesse ve ark. (98) kronik stres uygulamasının ardından gözlenen ağırlık azalmasını, besin alımındaki azalma ile ilişkilendirmişlerdir. Dişi sıçanlar kullandığımız bu çalışmada, 8 haftalık deney prosedürü sonunda, önceki çalışmalara paralel olarak deneklerin kilo alma oranlarında ve ovaryum ağırlıklarında, kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalma tespit edilmiştir.

Organizmalar, çevreleri ile denge kurarak ayakta kalmaktadır. Stresin kontrol altına alınması ve adaptasyon, bu denge için önemlidir. Stres uyaranları bireylerde, fizyolojik ve psikolojik özellikleri değiştirebilmektedir. Kısıtlama stresi (immobilizasyon stres) de fizyolojik ve psikolojik streslerin bir kombinasyonu olarak görülmektedir. Bununla birlikte, kısıtlama stresinin duygusal davranış üzerine etkileri değişkenlik göstermektedir. Araştırmacılar kısıtlama stresi sonucu, deneklerde gözlenen farklı davranışsal sonuçların, deneklerin var olan duruma adaptasyon yeteneklerinden kaynaklanabileceğini belirtmişlerdir. Bu adaptasyon ise deney modelinin uygulanma şekli ya da maruziyet süresiyle ilişkili olabilir (99).

Çalışmamızda, 8 hafta süreyle, immobilizan kısıtlama stresine maruz bırakılan dişi erişkin deneklerde, uygulanan stresin lokomotor aktiviteler üzerine etkileri rota rod testi ile değerlendirilirken, stres kaynaklı anksiyete için, altın standart kabul edilen, açık alan ve yükseltilmiş artı labirent testleri kullanılmıştır. Ramos-Ortolaza ve ark. (100), izolasyon stresi uyguladıkları dişilerde, lokomotor aktivitenin diöstrus fazında diğer fazlardan daha yüksek olduğunu bildirseler de çalışmamızda metöstrus fazındaki deneklere uygulanan rota rod testi sonucunda, kontrol ve stres grupları arasında, lokomotor aktivite açısından herhangi bir değişiklik saptanmamıştır.

Uzun süreli strese maruz kalınması canlıda kaygı, depresyon ve anksiyete gibi duygu durum bozukluklarına karşı hassasiyetin artmasına katkı sağlamaktadır (101). Çalışmamızda anksiyeteyi değerlendiren bir ölçüt olarak açık alan testinde, stres grubu deneklerin periferde ve hareketsiz kalması, artı labirent testinde ise kapalı kola girme sıklığının kontrol grubundan fazla olması, deneklerde anksiyete varlığı olarak değerlendirilmiştir. Son zamanlarda strese karşı davranışsal ve fizyolojik değişiklikler değerlendirilirken, cinsiyet farklılığını göz önünde tutan çalışmalar ağırlık kazanmaktadır. Luine ve ark. (102), kısıtlama stresi sonrasında bu iki test için, erkek sıçanlarda anksiyete artışı, dişi sıçanlarda ise durum değişikliğinin olmadığını bildirmişlerdir. Pek çok çalışma, dolaşımdaki yüksek östradiol seviyesinin dişilerde, kronik strese karşı bireysel dayanıklılık sağladığını göstermekle birlikte, hormonal seviye değişikliklerinin dişileri anksiyete bozukluklarına karşı daha hassas hale getirdiğine dair çalışmalar da bulunmaktadır (103). Bazı çalışmalar, yüksek seviyede östrojene sahip olmamaları

72

nedeniyle, erkeklerin depresyona daha yatkın olduklarını bildirirken, hormonal değişikliklere maruz kalmadıkları için, erkeklerin strese karşı dişilerden daha dirençli olduğunu öne süren çalışmalar da bulunmaktadır (104). Gerçekten de dişilerde puberte, gebelik ve perimenopozal dönem, belirgin hormonal durum değişikliklerinin yaşandığı evrelerdir ve depresyon-anksiyete oluşma riskinde artış ile yakından ilişkilidir (103). Erkek ve dişiler arasında, yukarıda bahsedilen farklılıklara cevap arayan çalışmalar, stres sırasında östrojenin rolü üzerine odaklanmaktadır.

Çalışmamızda östrus siklusu takibi ile immobilizan stres süresince olası hormonal değişikliklerin tespit edilmesi amaçlanmıştır. Östrus döngüleri, ovaryumda, uterus ve vajinada morfolojik değişiklikler ile karakterizedir (105). Östrus siklusu boyunca salınan gonadal steroidler, dişide strese karşı immun-inflamatuar yanıtları düzenleyen mediyatörler olarak düşünülmektedir (106). Stres kaynaklı menstrual siklus düzensizliğinde, merkezi ve periferal yolaklar aktive edilir. Bu aktivasyon sonucunda HPG ekseninin inhibisyonu gerçekleşmektedir (107,108). Bununla birlikte literatürde, stresin doğrudan menstrual siklus düzensizliği üzerine etkilerini ortaya koyan sınırlı sayıda çalışma mevcuttur. Çalışmamızda, stresin genital kanal üzerine etkilerini gözlemlemek için, kontrol ve stres grubu deneklerden deney süresince, günde 1 kez vajinal smear örneği alınmıştır. Vajinal smear yöntemi, kolay uygulanabilen ve hızlı veri sağlayan bir teknik olarak kabul edilir (109). Dorfman ve ark. (110) sıçanlar üzerinde yaptıkları kronik soğuk stresi sonucunda, 3 ve 4 hafta süreli stres gruplarının östrus sikluslarında değişiklik gözlenmediğini vurgulamışlardır. İnsan olmayan primatlarla yapılan bir çalışmada ise menstrual döngünün foliküler fazı boyunca, 5 gün süreyle inflamatuvar benzeri bir stres atağı uygulanmış ve tüm maymunlarda foliküler fazın önemli ölçüde uzadığı tespit edilmiştir (111).

Çalışmamızda düzenli olarak incelenen smearler sonucunda elde ettiğimiz bulgular, kronik fizyolojik stresin dişi genital kanal üzerine etkilerini ortaya koymaya desteklik sağlamış ve ayrıca çalışmamızın özgün değer taşımasına katkıda bulunmuştur. Detaylı bir şekilde incelenen smearler sonucunda, stres grubu deneklerinin her fazına ait örneklerde, normal hücre populasyonunun yanı sıra nötrofillerin varlığı saptanmıştır. Bu durum, strese yanıt olarak MSS’nin stres yanıtını düzenlemek ve homeostazisi korumak için inflamasyon başlattığı ve devam ettirdiğine dair çok sayıda bulgu ile açıklanabilir (112). Bununla birlikte, stres grubu deneklerimizde, deney süresince tekrarlanan siklus sayısındaki azalma, metöstrus ve diöstrus fazlarının süresindeki artış nedeniyle ortaya çıkmıştır. Ayrıca stres grubunda, bir siklusun süresinde ve diöstrus indeksinde artış gözlenmiştir. Bununla ilişkili olarak, Xiao ve ark. (107) inflamatuar/immün-stres uyguladıkları çalışmalarında, östradiol seviyesinin baskılandığını bildirmişlerdir. Diğer yandan, Ramos-Ortolaza ve ark. (100) ise izolasyon stresi uyguladıkları

73

dişilerde, östrus fazı süresinde artışın yanı sıra, proöstrus gözlenmeyen siklusların oluştuğunu rapor etmiştir. Stres ile aktive edilen sistemlerin hipotalamusta, hipofiz bezinde ya da üreme organlarında etki göstererek çoğalmayı olumsuz yönde etkilediği bilinmektedir (113).

Çalışmamızda değerlendirilen diğer bir fizyolojik parametre de serum kortizol seviyesidir. Yaptığımız literatür taraması sonucunda, maruz kalınan stres etkeninin tipi, süresi ve cinsiyete bağlı olarak, ölçülen serum kortizol seviyesinin değişkenlik gösterdiği tespit edilmiştir. HPA ekseni, stres reaksiyonlarını indükleyebilecek ekzojen ve endojen faktörler tarafından uyarılır, böylece fizyolojik tepkiler tetiklenmiş olur. HPA ekseni, uyarıcı sinyalleri aldığında, glukokortikoidlerin salgılanması artmaktadır (114). Kortizol, en önemli stres belirteci olan glukokortikoid türüdür. Normal bir ovaryumda, folikül gelişimi ve yüksek kalitede oositlerin üretimi, endokrin sistemin düzgün çalışmasına bağlıdır. HPA ekseni stres ile uyarıldığında, dişi üreme sistemi üzerinde engelleyici etkilere yol açmaktadır (115).

Dişi sıçanların kullanıldığı bir çalışmada, 3 ve 4 hafta boyunca kronik soğuk stres ugulaması sonucunda, her iki stres grubunun serum kortizol seviyelerinde, kontrol grubuna göre bir değişiklik olmadığı saptanmıştır (110). Aynı stres faktörüne maruz kalan farklı hayvanlar farklı kortikosteron düzeylerine sahip olabilir; bu da deneysel değişkenliğin artmasına neden olmaktadır (99). Galea ve ark. (116) erkek sıçanlarda, kısıtlama stresinin 14. gününde kortikosteron seviyelerinin, 1. ve 7. günlere kıyasla daha düşük olduğunu tespit etmişlerdir. Benzer şekilde Cengiz (117) stres ile indüklenen kortizol seviyesi artışının, akut cevap olarak ortaya çıktığını bildirmiştir. Yirmi bir gün, günde üç saat kronik kısıtlama stresine maruz bırakılan erkek sıçanlarda serum kortikosteron miktarının kontrole göre anlamlı olarak arttığı belirtilmiştir (118). Erkek ve hamile dişi sıçanların kullanıldığı başka bir çalışmada ise, 15 gün, günde üç defa 30 dakika uygulanan kısıtlama stresinin dişilerde kortikosteron seviyesini arttırırken, erkek sıçanlarda bir değişiklik yapmadığı gösterilmiştir (12). Bu bulgulara benzer şekilde, kronik stres uygulanan çalışmamızda, stres grubu serum kortizol seviyeleri ile kontrol grubu arasında farklılık gözlenmemiştir. Bu durum, deney başlangıcından sonuna kadar izlenen davranış değişlikleri ile birlikte değerlendirildiğinde, deneklerin var olan stres koşullarına alışıp, homeostazisi sağladığını düşündürmektedir.

Bununla birlikte, önceki çalışmalarda dişi genital kanalda tanımlanmış olan CRH ve reseptörlerinin, ovaryumda apoptozu indüklediği (119), yüksek strese maruz kalan kadınlarda POY ile ilişkili olduğu ve ovaryum içi parakrin faktörlerin değişimine neden olarak infertiliteyle ilişkili olabileceği (115) öne sürülmektedir. Bu bulgular, stresin dişi üreme sistemi üzerine

74

etkileri araştırılırken serum kortizol seviyesinin yanı sıra, ovaryum CRH seviyesinin de göz önünde tutulması gerektiğini düşündürmektedir.

Strese maruziyetinde ovaryum fonksiyonlarını test etmeye yönelik çok sayıda çalışma olmakla birlikte, kronik stres uygulaması sonrasında, ovaryum dokusunda histolojik değişiklikleri değerlendiren sınırlı sayıda çalışma mevcuttur. Çalışmamızda stres grubu diöstrus fazındaki ovaryumlarda, sağlıklı folikül sayısında belirgin azalma ile birlikte atretik folikül ve interstisyel bez oluşumunda artış gözlemlenmiştir. İmmobilizasyon stresi farelerde primer,