Organizma, enfeksiyon etkenine birbirini takip eden iki önemli savunma hattında karşı koyarak hastalıktan korunmaya veya hastalık oluşmuşsa etkenin
üstesinden gelmeye çalışır. Birinci hat savunmasını doğal direnç mekanizmaları oluşturur. Bu mekanizmalar, mikroorganizmalar için seçicilik göstermeksizin (non-spesifik), konağın patojen mikroorganizmaya maruz kalmasını izleyen ilk saatler içinde enfeksiyonu sınırlamaya yönelik olarak fonksiyon gösterirler. Doğal immünitenin başlıca hücreleri makrofajlar ve NK hücreleridir. Bu reaksiyona granülositler de (özellikle nötrofiller) katılırlar. İkinci hat savunması, kazanılmış (spesifik, adaptif) immünite için çalışan mekanizmaların harekete geçmesi ile başlar. Bu savunma, organizmanın antijene primer ve sekonder cevabına göre, belli bir süre sonunda, humoral ve/veya hücresel düzeyde ve etkene spesifik bir immünitenin kazanılması ile elde edilir (106).
İmmün cevap, kendi kalıtsal yapısına yabancı antijen moleküllerini tanıma yeteneğinde bağışıklık sistemi olan canlının, patojenlere karşı oluşturduğu reaksiyonlardır. Konak organizmaya giren yabancı patojenler, antijen sunucu hücreler (antigen presenting cells, APC) tarafından karşılanmakta ve lenfositlere sunulmaktadır. Timusa bağımlı antijenler ile karşılaşan APC, antijenleri Th lenfositlere sunarken, IL-1 salarak lenfositlerin çoğalmalarına ve lenfokin salgılamalarına yol açmaktadır. Bir endojen pirojen olan IL-1, ateş yükselmesine ve granülositoz oluşmasına neden olmaktadır. Timusa bağımsız antijenler doğrudan B lenfositlere sunulmaktadır. APC tarafından uyarılan Th lenfositlerin saldıkları lenfokinler, T ve B lenfositleri farklılaştırmakta ve immün cevap ürünlerinin oluşmasını sağlamaktadır (174).
3.3.1. Sitokinler
Sitokinler, doğal ve spesifik immün yanıt oluşumunda, immün sistem hücrelerinin karşılıklı ilişkilerini düzenleyen protein veya glikoprotein yapısında maddelerdir (2, 28). Hücreler arası sinyal molekülü olan sitokinler, inflamasyon, hücre büyümesi, hematopoez ve yara iyileşmesi gibi farklı birçok olayın düzenlenmesinde yer alırlar (2, 166).
Aktif T lenfositleri tarafından sentezlenip salınanlar lenfokin, aktif monosit/makrofajlardan sentezlenip salınanlar monokin ve lökositler arasında etkileşim yapanlar ise interlökin olarak adlandırılmıştır. Fakat, günümüzde bu maddelerin, bu gruptaki hücrelerden başka hücrelerden de sentezlenip salındığının keşfedilmesiyle genel bir tanım olarak sitokin deyimi kabul görmeye başlamıştır (174).
Sitokin olarak adlandırılan, bu heterojen protein grubunun ortak karakteristik özellikleri şunlardır (1, 18, 157, 166, 171):
- Düşük molekül ağırlığına sahiptirler (80 kDA’dan küçük).
- Son derece potenttirler, genellikle pikomolar konsantrasyonlarda fonksiyon gösterirler.
- İmmün cevabı, şiddetlendirmek veya baskılamak suretiyle düzenlerler.
- Lenfoid hücrelerin ve diğer bazı hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını sağlarlar.
- Her sitokin ya da sitokin grubu, kendisi için spesifik, yüksek affiniteli hücre yüzey reseptörleri ile reaksiyona girer. Sitokinlerin hücre yüzeyindeki reseptörüne bağlanması, hücrenin RNA yapısını ve protein sentezini etkileyerek, hücrenin fonksiyonunda değişime yol açar.
- Kemik iliğine etki ederek hematopoietik regülasyona da katılırlar.
-Bazı hipofiz hormonlarının ve diğer biyolojik maddelerin sentez ve salınmalarına neden olabilirler.
- Ateş ve akut faz cevabını oluştururlar.
- Antiviral etkinlik gösterirler (özellikle interferonlar).
- Etkileri genelde otokrin veya parakrin şekildedir ve etki süreleri oldukça kısadır (saniyeler-dakikalar ile sınırlıdır). Bununla birlikte, bir kısım sitokinler endokrin yolla vücudun uzak bölgelerine periferik dolaşım ile ulaşarak, bu bölgelerde de etkili olurlar. Böylece, serumda bazı durumlarda saptanabilir konsantrasyona ulaşabilirler. Örneğin: Meningokokal menenjit (247), lepramatöz lepra, leyişmaniyöz (189), gonore (90) ve kandidiyoz (211) gibi enfeksiyöz durumlarda, polimiyalji romatika (240) gibi otoimmün hastalıklarda, çeşitli çoğul organ yetmezliği durumlarında (84), akut pankreatitte (91), endometriosiste (179), prostat kanserinde (6) ve miyokard infarktüsünde (145) hastalık seyri ile yüksek serum sitokin seviyeleri arasında ilişki olduğu bildirilmektedir (28).
Antijen bağlanmasını takiben, aktive olan T lenfositler, başta IL-2, IL-4 ve IFN-γ olmak üzere ilk sitokin grubunu sentezlerler. Monositler, T lenfositlerden sentezlenen sitokinlere cevap olarak, ikinci grup sitokinleri oluştururlar. Tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve IL-1’in de içinde yer aldığı bu monosit ürünleri, immün fonksiyonu olan hücreler üzerinde düzenleyici etkilere sahiptirler. Takip eden immünolojik olayları artıran ya da baskılayan sinyaller oluştururlar. Aktif monositlerin diğer ürünleri (prostaglandinler ve lökotrienler) immün sistem hücrelerinin aktivasyonunu etkilerler. Tüm bu kompleks ilişkiler bütününe sitokin ağı adı verilmektedir (114, 215).
Sitokinler, fonksiyonel olarak şu şekilde sınıflandırılabilir (103):
- Yangıyı teşvik edici (Proinflamatuar) sitokinler: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α - Yangıyı durdurucu (anti-inflamatuar) sitokinler: IL-10, IL-13, TGF-β
- İmmün regülatör sitokinler: IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IFN-γ ve TGF-β
- Anti-infeksiyöz sitokinler: IFN-α ve β, IFN-γ (viruslar), TNF-α (bakteriler) - Hematopoezi teşvik eden sitokinler: G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-5 ve IL-7
- Anti-proliferatif sitokinler: IFN-γ, TNF-α, TGF-β
3.3.1.1. Interferon-gamma (IFN-γ)
21-24 kD molekül ağırlığına sahip olan, immün ya da tip II interferon olarak da bilinen homodimer yapıda bir glikoproteindir. IFN-γ, başlıca Th1 hücreleri, CD8+ T hücreleri, NK hücreleri, B lenfositleri, dendritik hücreler ve aktif makrofajlardan salınır (1, 106, 171). Antiviral etkiyi artıran IFN-γ, ayrıca mononükleer fagositlerin güçlü bir aktivatörüdür. IFN-γ, temel Makrofaj Aktive Edici Faktör’dür (MAF), bunun yanı sıra, Major Histokompatibilite Kompleksi-I (MHC-I) molekül ekspresyonunu artırır, nötrofilleri aktive eder, NK hücrelerin sitolitik aktivitelerini uyarır ve TNF’nin endotel hücrelerine olan etkilerini güçlendirir (1, 171). IFN-γ, hücre aracılı immün yanıtın yönlendirilmesinde önemli rolü olan bir sitokindir (64).
3.3.1.2. Interlökin-4 (IL-4)
20 kD ağırlığında bir glikoproteindir. Temel fizyolojik etkisi alerjik olayları düzenlemektir. Antijenle uyarılmış CD4+ T lenfositlerinden, özellikle Th2 alt grubundan salgılanırlar. B ve T lenfositlerinin büyüme, etkinlik ve farklılaşmasından sorumludurlar. Aktive mast hücreleri, bazofil hücreler ve bazı CD8+ hücreleri de IL-4 üretirler (1, 171, 227).
IL-4, B hücre büyüme faktörü 1 (BCGF-1) veya B hücre uyarıcı faktör 1 (BCSF-1) olarak da bilinir. IL-4 kodlayan genler 5. kromozom üzerindedir. Bu bölge IL-3, IL-5, granülosit/monosit- koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve monosit- koloni uyarıcı faktör (M-CSF) reseptör genlerini de bulundurduğundan hemopoezde önemlidir (97). IL-4, B lenfositler ve monositler üzerinde IgE’nin düşük affiniteli reseptörünün (CD23) belirmesini artırır (232). IgE üretimi için gerekli olan ve B hücrelerinin bu ağır zincir izotipine değişimini uyaran temel sitokindir. IgE, ani hipersensitive (alerjik) reaksiyonların aracısıdır ve IL-4 üretiminin artışında allerjenlerin gelişiminin de merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir (1, 171, 227). Bu sitokinin antikoagulan etki de gösterebildiği ayrıca helmint enfeksiyonlaronda da rol aldığı bildirilmektedir (238).
IL-4, makrofaj aktivasyonunu inhibe eder ve IL-1 gibi sitokinlerle, nitrik oksit (NO) ve prostaglandinlerin üretimindeki artış da dahil, IFN-γ’nın makrofaj aktive edici etkisini bloke eder. Özellikle Th2 alt grubu dahil olmak üzere T hücrelerinin, büyüme ve farklılaşmasında rol oynar. Endotel hücreleri üzerine etki ederek, lenfosit, monosit ve özellikle eozinofillerin bağlanmasınında artışa neden olan Damar Hücresi Adezyon Molekülü-1’in (VCAM-1) ekspresyonunu uyarır. IL-4’e maruz kalan endotel hücreleri bir kemokin olan Monosit Kemotaktik
Protein-1’i (MCP-1) ve özellikle eozinofillere etki eden henüz tanımlanmamış bir kemokini (Eotaksin) salgılarlar. Yani, yüksek lokal konsantrasyonlarda, IL-4 monosit ve eozinofilden zengin inflamatuar reaksiyonları başlatır (1, 171, 227).
3.3.1.3. İnterlökin-10 (IL-10)
18 kD molekül ağırlığında bir sitokin olup, CD4+ yardımcı hücrelerinin Th2 alt grubu tarafından üretilir. Ayrıca, bazı aktive B hücreleri, insanlarda Th1 hücreleri (101, 258), timositler, Epstein-Barr virusu ile infekte hücreler (174), aktive makrofajlar ve bazı non-lenfositik hücre tipleri (keratinositler) tarafından da üretilir. IL-10’un iki önemli fonksiyonu vardır. Birincisi; makrofajlar tarafından sitokinlerin (TNF, IL-1, IL-12, kemokin) üretimini engellemek, ikincisi ise makrofajların T hücre aktivasyonundaki işlevlerini engellemektir. Bu ikinci etkiyi, MHC-II moleküllerinin ve bazı yardımcı uyarıcıların ekspresyonunu azaltarak yapar. Bu etkilerin sonucunda, T hücresi aracılığıyla gelişen hücresel immün yanıt inhibe edilir (1, 166). IL-10’un, IL-2 ve IFN-γ sentezinin inhibisyonu, IL-6, IL-8, GM-CSF, G-CSF sentezinin inhibisyonu, NK ve makrofaj aktivasyonunun inhibisyonu, reaktif NO yapımının baskılanması, B hücre çoğalması ve farklılaşmasının indüklenmesi gibi etkileri de vardır (106).
IL-10, temel olarak yangısal reaksiyonları baskılar. Birçok infeksiyon sırasında IFN-γ cevabına IL-10 yapımı da eşlik eder. Bunun Tip 1 sitokin cevabı ile oluşabilecek doku hasarının en aza indirilmesi amacıyla gerçekleştiği sanılmaktadır (106).
3.3.2. T lenfositleri
Timusun kontrolünde olgunlaşarak ikincil lenfoid organlarda yerini alan T lenfositleri, hücresel immün yanıttan sorumlu olan hücrelerdir (174). Kemik iliğinden çıkarak, kortiko-medullar kavşaktan timusa giren öncü T hücreleri (27), timus korteksinde hızla çoğalır ve çeşitli nöroendokrin uyaranların etkisiyle olgun T hücresinin fonksiyonel özelliklerini kazanırlar (74). Olgunlaşmamış T hücreleri timustaki gelişimleri süresince T hücre reseptörü (TCR) genlerinin yeniden düzenlenmesi ve hücre yüzey moleküllerinin ekspresyonundaki değişimleri de kapsayan süreçte pozitif ve negatif seleksiyona tabi tutularak olgunlaşırlar (62, 148, 168). Kanda dolaşan küçük lenfositlerin %78-80’i T lenfositleridir. Kanda 1- 2.5x109/litre kadar T lenfositi bulunmaktadır. Bunlardan CD4 reseptörüne sahip olanların sayısı 0.5-1.6x109/litre, CD8 reseptörüne sahip olanların sayısı ise 0.3- 0.9x109/litre’dir. T lenfositlerini B lenfositlerinden ayıran temel özellik, T lenfositlerinin mevcut CD2 reseptörleri aracılığıyla koyun eritrositlerine bağlanmasıdır. Bu özellikten yararlanılarak, rozet testi ile T lenfositler tanımlanır (174).
T lenfositleri, olgunlaşma sürecinin sonrasında, naif (uyarılmamış) CD4+ veya CD8+ timus hücresi olarak periferal T hücre havuzuna göç edip Th CD4+ ya da sitotoksik T (Tc) ve supressör T (Ts) CD8+ hücresi olarak döngüyü tamamlamış olurlar (103, 106, 174). Fare ve insan T hücreleri üzerinde yapılan çalışmalar, Th hücrelerinin farklı tipleri olduğu sonucunu ortaya çıkarmıştır. CD4+ hücreleri, sitokin üretim profillerine göre Th0, Th1, Th2 ve Th3 hücreleri olarak sınıflandırılmaktadır (157, 212, 218). Th1 hücreleri, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-γ ve TNF-β gibi sitokinler salgılayarak, hücresel bağışıklığın
düzenlenmesinde; Th2 hücreleri de, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 ve IL-13 salgılayarak, humoral bağışıklığın düzenlenmesinde rol alırlar (118, 219). Hücre aracılı immünitede rol oynayan Th1 hücresine ait sitokinler, gecikmiş tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarında işe karışırken; humoral immün cevapta rol alan Th2 hücrelerine ait sitokinler ise, hızlı tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarında rol oynamaktadır (3, 157, 218).
Günümüzde, bireysel toleransı (self-tolerance) koruma ve etkili bir immün cevap oluşumu için kritik önemi olan Th1 veTh2 kaynaklı sitokinler aracılığıyla, immün dengenin (Th1/Th2) korunduğu kabul edilmektedir (165). Otoimmün hastalıkların patogenezinde Th1 ve Th2 dengesinin önemi vurgulanmaktadır. Bu hastalıklarla ilgili olarak Th1 ya da Th2 baskınlığının çok kritik bir öneme sahip olduğuna dair deliller her geçen gün artmaktadır (93). Örneğin, alerji ve astım gibi çeşitli hastalıklarda, Th2 sitokinlerinin seviyesinin Th1 hücrelerinden salgılanan sitokinlerden daha yüksek olduğu (98); pre-eklampsi hastalarında ise IL-2 ve IFN- γ seviyelerinde artış tespit edilmişken, Th2 sitokini olan IL-4 düzeyinin ise azaldığı belirlenmiştir (217). Sağlıklı gebelikte PBMC kültürlerinde, IL-4 üretiminden sorumlu m-RNA ekspresyonunda anlamlı bir artış olduğu bildirilmiştir (239). Bir Th2 sitokini olan IL-10’un abortus eğiliminde olan farelere enjeksiyonu ile fetal kaybın önlenebildiği gösterilmiştir (48). IL-10’un normal gebeliğin sürdürülmesinde gerekli bir Th2 sitokini olduğu düşünülmektedir (49). Konuyla ilgili olarak, Boztosun ve arkadaşları (28) tarafından yapılan bir çalışmada, serum IL-10 konsantrasyonları tüm gebeliklerde gebe olmayanlardan daha yüksek değerlerde saptanmış ve başarılı gebeliklerin artmış IL-10 konsantrasyonları ile ilişkili olduğu, rekürren spontan abortus’lu
(RSA) kadınlarda istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte serum Th1 cevabı artışı eğiliminin gözlenmesi, RSA ile Th1 baskınlığı arasında ilişki olabileceği, sağlıklı gebeliklerin ise periferik kanda artmış Th2 cevabı ile ilişkili olduğu rapor edilmiştir.
3.3.3. Timus bezi
Timus, lenfoid organlar arasında endoderm, mezoderm ve ektoderm olmak üzere her üç tabakadan da hücre içermesi bakımından benzeri olmayan bir organdır. Fetal yaşamın 6. haftasında şekillenir (174) ve yeni doğanda 12-15 gram kadar olup, pubertede 30-40 grama kadar büyür. İleri yaşlarda ise yağ dokusuna değişim göstererek 10-15 grama kadar iner (106).
Anatomik konum olarak, sternumun arkasında üst mediastinuma yerleşik ve kapsülle sarılı iki loptan oluşan lenfoid bir organdır. Timusu saran konnektif doku orjinli kapsül, loblar içine trabeküla denilen uzantılar göndererek lobülleri oluşturur. Her lobül, korteks ve medulla olmak üzere iki bölgeye ayrılır (106). Lenfoid hücreler korteks kısmında yoğun, medullada seyrektir. Timusa gelen ön lenfositler, korteksten medullaya geçerken, medullada bulunan epiteloid hücrelerin salgılarıyla olgunlaşarak T lenfositlere dönüşürler (174).
Hücresel tip immün cevapta etkili olan timusun (174) korteksini, esas itibariyle, retiküler fibrillerle çevrili ve gelişmenin değişik evrelerinde bulunan lenfosit kümeleri (timositler) oluşturur. Medullada ise çoğunlukla epitelyal hücreler ve dağınık halde seyrek lenfositler bulunur. Bunlar olgun T lenfositleridir (106).
Şekil 3.6. Sıçanda timus bezinin anatomik konumu.
4. GEREÇ VE YÖNTEM
4.1. Deney hayvanları
Çalışmada, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Araştırmalar Merkezi’nden (FÜTDAM) sağlanan, 220-250 gr ağırlığında 21 adet Wistar Albino cinsi intak erkek sıçanlar kullanıldı.