Para o estudo da especificidade seleccionamos uma das famílias de enzimas que actua quer nas células saudáveis quer nas células cancerígenas, as cinases. Efectuamos a comparação das constantes de dissociação apresentadas pelas cinases que actuam quer nas células saudáveis, quer cancerígenas e uma das cinases que actuam especificamente nas células cancerígenas, a AURKA. Para esta comparação foram escolhidos os ligandos que ao interagirem com a AURKA apresentaram melhores energias de interacção, e realizamos o docking entre estes ligandos e algumas das cinases que actuam em células cancerígenas e em células normais.
As cinases utilizadas para estabelecer uma comparação em termos de especificidade com a cinase AURKA encontram-se representadas na seguinte tabela juntamente com a família à qual pertencem.
Tabela 7: Cinases utilizadas no estudo da especificidade e respectiva família. [68]
Família Cinase JAK JAK3 Src SRC RAF BRAF TGBFR TGFBR1 Sub-família p38 MAPK12 PKC PRKCD MAPKAP MAPKAPK2
Resultados e Discussão
69 células cancerígenas e da cinase AURKA. Desta forma, determinamos a especificidade
dos compostos em relação às cinases estudadas, os resultados obtidos encontram-se representados nas figuras seguintes.
Figura 21: Valores da proporção entre as constantes de dissociação da cinase AURKA e as famílias de cinases estudadas para VJH-6.
Figura 22: Valores da proporção entre as constantes de dissociação da cinase AURKA e as famílias de cinases estudadas para VJH-8.
Figura 23: Valores da proporção entre as constantes de dissociação da cinase AURKA e as famílias de cinases estudadas para NHR-38.
Resultados e Discussão
Figura 24: Valores da proporção entre as constantes de dissociação da cinase AURKA e as famílias de cinases estudadas para NHR-47.
Figura 25: Valores da proporção entre as constantes de dissociação da cinase AURKA e as famílias de cinases estudadas para VJH-21.
Neste tipo de estudos é importante determinar a especificidade dos compostos em relação a alvos diferentes daqueles que são objecto de estudo, utilizando por exemplo enzimas que actuem tanto em células saudáveis como em células cancerígenas. O estudo da especificidade é realizado para poder prever a ocorrência de efeitos indesejáveis, devendo os compostos apresentar uma maior especificidade em relação ao alvo desejado do que em relação a outros alvos.
Com base nos resultados obtidos, verifica-se que os compostos estudados apresentam uma especificidade muito superior para com a cinase AURKA quando comparados com determinadas famílias de cinases estudadas, como são o caso das famílias Src, PKC, TGBFR e MAPKAP. Apresentando os compostos em média uma especificidade 316, 78, 144 e 81 vezes superior para a cinase AURKA do que para as cinases das famílias Src, PKC, TGBFR e MAPKAP, respectivamente.
Resultados e Discussão
71 Em relação a algumas das famílias de cinases estudadas, os compostos
apresentaram uma especificidade semelhante àquela que apresentam para a cinase AURKA. Esta situação verifica-se em relação às famílias RAF, JAK e p38, uma vez que os compostos apresentam em média, respectivamente, uma especificidade de 7, 4 e 12 vezes superior para a cinase AURKA do que para as famílias de cinases referidas anteriormente.
5.1.7. Testes de Enriquecimento
Foram realizados testes de enriquecimento, construindo para este fim uma base de dados de ligandos para cada uma das enzimas submetidas a este teste. Esta base de dados é constituída por 1000 ligandos falsos e por um conjunto de 20 ligandos (ligandos conhecidos e os melhores ligandos determinados por docking em relação a cada enzima). Os ligandos falsos foram obtidos a partir da base de dados DUD, Directory of
Useful Decoys, tendo sido seleccionados com base nas suas propriedades (peso
molecular, o número de aceitadores de ligações de hidrogénio, o número de doadores de ligações de hidrogénio e o número de ligações com rotação livre), devendo estas serem semelhantes às dos ligandos conhecidos. [69]
Realizou-se o docking entre as enzimas e os compostos da base de dados, tendo sido posteriormente classificados os compostos de acordo com as energias de interacção. Os resultados obtidos para algumas das enzimas estudadas encontram-se seguidamente representados, no entanto, no Anexo D encontram-se as representações gráficas para os restantes testes de enriquecimento realizados.
Figura 26: Teste de Enriquecimento realizado para a enzima CDC7.
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 % de li ga nd os co nh ec id os en co nt ra do s
Resultados e Discussão
Figura 27: Teste de Enriquecimento realizado para a enzima CDK4.
Nos gráficos acima representados a linha vermelha exemplifica uma situação na qual a selecção dos ligandos é realizada de uma forma aleatória, enquanto que a linha azul indica a representação obtida para cada caso estudado. Os resultados obtidos realizando o teste de enriquecimento são tanto melhores quanto mais para a zona esquerda do gráfico se situar a linha azul.
Através da análise das representações obtidas, verifica-se que a realização do teste de enriquecimento provocou um enriquecimento de aproximadamente seis vezes para a enzima CDC7, já que foram seleccionados 80% dos ligandos conhecidos percorrendo cerca de 15% da base de dados. No entanto, o enriquecimento obtido para a enzima CDK4 foi muito menos significativo, tendo provocado um enriquecimento de cerca de duas vezes até atingir 50% da base de dados, uma vez que ao percorrer esta percentagem da base de dados seleccionou 80% dos ligandos conhecidos. A partir dos 50% da base de dados percorrida, o enriquecimento sofre um decréscimo acentuado.
Analisando os resultados dos testes de enriquecimento efectuados para as enzimas em estudo é possível observar que existem alguns casos em que não se verificou um enriquecimento elevado, como é o caso das enzimas NA, RNAP (bactéria) e TOPOII.