İki Lanchester dengeleme mili (iki çift mil) ile dengeleme

As figuras 11 e12 ilustram o método TUNEL, utilizado para comprovar a presença de apoptose no tecido vesical dos grupos I e II. Observar a coloração em verde dos núcleos, representando presença de apoptose nos grupos I e II.

Figura 11: observar presença de núcleos apoptóticos corados em verde no grupo I

Figura 12: Observar a maior presença de núcleos corados em verde representando o processo apoptótico no grupo II (senil).

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4 DISCUSSÃO

Com o envelhecimento masculino há aumento da prevalência de inúmeras doenças que envolvem diferentes sistemas com ação direta e indireta sobre trato urinário inferior, gerando sintomas de enchimento e esvaziamento vesical. O estudo de Robertson, 2007 demonstrou uma freqüência de sintomas de LUTS entre 8 e 31% dos homens na idade de cinqüenta anos, aumentando para 44% aos setenta anos.

Um dos denominadores comuns relacionados aos sintomas citados acima é a queda dos níveis de testosterona proporcional ao avanço da idade. Muitos estudos têm tentado estabelecer a relação entre os níveis de hormônios sexuais e HBP, entretanto raras são as pesquisas envolvendo a análise da relação entre testosterona circulante e disfunção vesical. Pesquisa realizada no medline pelo presente pesquisador (FL) na data de 17/07/2009 com as palavras “testosterone, apoptosis, bladder”, resultou somente em um artigo. Andrógenos modulam uma ampla variedade de funções durante a embriogênese e a idade adulta, destacando-se a testosterona e seu metabótlito, a 5–alfa- diidrotestosterona. Embora esses hormônios apresentem características diversas, acredita-se que seus efeitos sejam mediados via produtos protéicos de um único receptor androgênico, cujo gene é codificado no cromossomo X (Roy & Chatterjee, 1995; McPahaul & Young, 2001).

Uma das indagações ainda não esclarecidas na literatura é o mecanismo pelo qual receptores nucleares (como os receptores para andrógenos) modulam a atividade de resposta gênica. Hipotetiza-se que a participação de um número expressivo de proteínas pode promover a ativação ou a inibição dos receptores nucleares. Ressalta-se também a necessidade de compreensão como os andrógenos são metabolizados nos diferentes tecidos e a interação receptor/hormônio nas diferentes células.

A conversão de testosterona em diidrotestosterona nas células alvo amplifica o sinal androgênico. Diferentemente do complexo testosterona/receptor nuclear, o complexo diidrotestosterona/receptor apresenta uma meia vida mais longa e,

  27 portanto, prolonga a ação androgênica, fundamentalmente pela menor reação oxido-redução, a qual é responsável pela inativação androgênica, sofrida pela diidrotestosterona nas células alvo. A elucidação das várias etapas da ação androgênica permitirá um maior conhecimento desse hormônio no trato urinário inferior (Lindzey et al., 1994).

Os efeitos da testosterona são mediados por dois mecanismos: - via receptor nuclear, a qual apresenta atividade dependente da expressão do DNA e localização dos receptores nos diferentes órgãos, sendo denominada ação genômica hormonal; - via não receptor, a qual envolve mecanismos de ação indiretos como a ação anti-inflamatória, anti-agregante plaquetária e ação sobre canais de cálcio e potássio (Lindzey et al., 1994). Uma das principais diferenças dessas vias é a velocidade de ação, onde são necessários ao menos 60 minutos para a ligação testosterona receptor/nuclear alterar a expressão gênica e obter o efeito desejado. Já a via não genômica é conhecida como via rápida, na qual em apenas alguns segundos ocorre o efeito (Unni et al., 2004).

Uma possível origem do processo inflamatório é a presença de alteração dos níveis hormonais. A prevalência aumentada da síndrome da dor pélvica crônica durante o processo de envelhecimento, associa-se com o decréscimo da concentração da testosterona, podendo-se associar a este fato a perda da ação anti-inflamatória da testosterona (Roberts et al., 1998).

Outra possível explicação é o decréscimo da concentração de prolactina levando a supressão da resposta anti-inflamatória pela testosterona e diidrotestosterona em níveis não hipogonádicos (Brann et al., 1989). Esta correlação implica que a ação anti-inflamatória dos andrógenos pode ser mediada pelo decréscimo da resposta mediada pela prolactina. Entretanto a inibição da prolactina não é, provavelmente, o único mecanismo de ação anti- inflamatória dos andrógenos.

Zhou et al., 1995 demonstraram que a diidrotestosterona tem uma ação anti- inflamatória superior à testosterona. Estudos in vivo demonstraram que o índice de dissociação máxima do receptor androgênico foi três vezes mais rápido para testosterona do que para diidrotestosterona e a testosterona foi menos efetiva

  28 como estabilizador do receptor contra a sua degradação (Wright et al.,1996). Experimentos estudando a termolabilidade, a qual mensura a estabilidade do complexo do receptor indicaram que foi necessária uma concentração de testosterona 10 vezes maior que a diidrotestosterona para manter a estabilidade.

No presente estudo observou-se que a queda rápida de testosterona sérica associou-se a uma expressão elevada da presença de fibras colágenas na parede vesical. Sabe-se que a diminuição de andrógenos pode inibir a diferenciação do tecido muscular liso. Andrógenos, através da ativação de seu receptor específico pode estimular células precursoras do estroma a se diferenciarem em musculatura lisa (Traish et al., 2007). Considerando o exposto no estudo de Traish e associado aos resultados desta pesquisa (FL) poderia-se inferir que o decréscimo dos níveis de testosterona foi capaz de promover aumento da concentração da densidade volumétrica de fibras colágenas.

Portanto, uma possível explicação para o aumento do processo fibrótico em bexiga de ratos castrados seria esta perda da diferenciação do estroma para tecido muscular, permitindo assim o aumento da concentração de fibras colágenas. Esse processo, ao menos parcialmente, poderia ser atribuído à função genômica (mediada por receptor) da testosterona que em conjunto com a ação não genômica (não mediada por receptor) anti-inflamatória poderiam contribuir ainda mais com o processo de fibrose vesical induzida pela queda rápida da testosterona.

Clinicamente, Celayir, 2003 demonstrou que a capacidade vesical máxima e a complacência diminuíram em pacientes com baixos níveis de testosterona. Esta evidência sugere que a reposição ou a profilaxia do hipogonadismo em homens poderia evitar ou amenizar os sintomas do trato urinário inferior, através da manutenção do equilíbrio fibra colágena/fibra muscular, alterado quando a capacidade e complacência vesicais encontram-se diminuídas.

Entretanto, deve-se destacar que no presente estudo, o comprometimento maior do processo fibrótico ocorreu com a queda rápida da testosterona e menos pronunciadamente nos ratos senis (queda lenta do hormônio),

  29 permitindo sugerir que as disfunções miccionais induzidas pela testosterona ocorreriam em maior prevalência em homens que desenvolvam hipogonadismo com supressão abrupta da testosterona.

Observou-se ainda neste trabalho, que o grupo de ratos senis apresentou maior percentagem de apoptose representada pela expressão imunohistoquimica do marcador de caspase-3 ativa e de menor densidade volumétrica de fibras colágenas quando comparado com o grupo orquiectomizado. Isto corrobora com a literatura, onde estudos como o de Gong et al., 2009, que, corando células de leydig com caspase 3 ativa observaram uma expressão aumentada de marcadores de apoptose, após deprivação de testosterona. Isto demonstra a ação da testosterona no processo celular de apoptose em diferentes tecidos.

Outro estudo de Corradi et al, 2004 demonstrou que baixos níveis de diidrotestosterona, induzidos pelo emprego da finasterida, promoveram acúmulo de fibras colágenas no tecido prostático. Com isto, pode-se inferir que a testosterona está intimamente ligada à resposta estromal, alterando a celularidade do tecido conjuntivo conectivo como sugere o pesquisador.

Discuti-se a possibilidade de que a percentagem de apoptose possa estar em maior quantidade no grupo senil em relação ao grupo orquiectomizado devido a sinais indutores de apoptose serem diferentes nos dois grupos. Estudo de Schuster & Krieglstein, 2002 sugere uma ação do TGF-beta1 como indutor de apoptose em animais idosos, o que poderia estar ausente no grupo jovem ou quando a queda rápida de testosterona ocorre.

Salienta-se também a possibilidade de que a bexiga de ratos não apresente níveis de apoptose expressivos suficientemente para serem detectados. Desta forma, pode-se inferir que, no grupo senil, os índices de morte celular sejam dramaticamente superiores aos ratos jovens devido o tecido vesical não expressar a caspase de forma adequada como o que ocorre em outros tecidos, como por exemplo, o tecido prostático.

A diferença entre os grupos pode também ser explicada pelo tempo de exposição dos ratos à orquiectomia (8 semanas), pela maior sensibilidade do

  30 tecido vesical de ratos senis à queda da testosterona e possível maior envolvimento de radicais livres quando ocorre queda lenta de testosterona como no grupo senil.

Em pesquisa experimental torna-se imprescindível a correta escolha do método empregado. No estudo das disfunções miccionais relacionados ao processo de envelhecimento, o emprego de animais orquiectomizados e animais senis tem sido descrito na literatura e utilizado de forma indiscriminada. Desta forma, os resultados obtidos nos estudos podem apresentar viés de seleção de método. Os resultados alcançados neste estudo trazem informações que permitem ao investigador a escolha do modelo experimental de acordo com a sua pesquisa. Sugere-se o emprego de animais orquiectomizados quando o objetivo do estudo for avaliar tecido conjuntivo vesical e de ratos senis quando a intenção for avaliar o processo de apoptose.

Tudo leva a crer que a testosterona possui ação na disfunção vesical através de sua ação genômica e não genômica. Recente linha de pesquisa de Riedmaier et al, 2009, empregou um modulador que atua seletivamente em receptores de andrógenos de tecidos alvos, mimetizando a testosterona. No estudo, este modulador teve como finalidade obter a ação benéfica sobre a osteoporose e a sarcopenia nos indivíduos com hipogadismo, entretanto sem os efeitos virilizantes do hormônio. Da mesma forma pode-se sugerir o emprego de um agonista androgênico no tratamento das disfunções miccionais relacionadas a níveis baixos de testosterona, com ação única sobre o tecido vesical.

Considerando o exposto acima, tem-se como objetivo futuro, o desenvolvimento de uma linha de pesquisa onde a ação da testosterona sobre as disfunções miccionais será abordada com detalhes, para que se possa evitar ou interromper o suposto efeito deletério da queda dos níveis de testosterona. Desta forma, pretende-se avaliar a possível interação entre DAEM, LUTS e níveis de testosterona.

  31

5 CONCLUSÕES

No período de tempo observado, podemos concluir que:

→ a intensidade de fibrose da parede vesical foi maior no grupo de ratos jovens orquiectomizados.

→ houve maior intensidade de apoptose no grupo senil em relação aos demais grupos.

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6 ANEXO

1- Gráfico densidade absoluta das fibras colágenas na bexiga 2- Relacão peso vesical/ peso corporal

3- Avaliação estatística das fibras colágenas

4- Contagem de pontos estereológicos das fibras colágenas 5- Grade das caspases

0 5 10 15 20 25

G rupo I G rupo II G rupo III

                        peso vesical/peso corporal  Grupo I  0,23        Grupo II  0,31        Grupo III  0,22                             

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  34   Grade para avaliação estereológica  das fibras colágenas      Anexo – 1 Contagem de pontos esterológicos Grupo Orquiectomizado

Campo rato 1 rato 2 rato 3 rato 4 rato 5 rato 6 rato 7 rato 8 rato 9 rato 10

1 27 34 31 34 31 30 27 27 29 30 2 30 33 33 28 31 28 30 24 33 28 3 27 33 29 32 33 26 23 21 26 32 4 28 31 32 32 25 23 32 28 29 28 5 29 24 33 31 26 29 32 24 30 30 6 22 33 30 30 32 25 28 21 34 30 7 30 32 33 29 32 25 26 24 30 28 8 25 32 33 26 30 26 26 25 32 26 9 24 24 27 34 36 26 25 23 29 26 10 22 23 35 30 29 27 19 26 32 22 MEDIA 26,4 29,9 31,6 30,6 30,5 26,5 26,8 24,3 30,4 28,555556 SD 3,026 4,383 2,3664 2,5473 3,24 2,068 4,022 2,3118 2,366 2,9257414 Grupo

Jovem rato 1 rato 2 rato 3 rato 4 rato 5 rato 6 rato 7 rato 8 rato 9 rato 10

1 7 3 6 6 5 5 4 4 3 5 2 8 6 4 6 4 6 5 5 4 5 3 5 6 9 5 5 7 9 5 3 5 4 5 5 6 13 7 7 5 4 3 8 5 7 7 4 5 5 4 5 7 5 4 6 4 3 7 8 4 4 6 3 4 5 7 8 6 5 7 5 3 5 4 3 5 8 3 4 9 8 6 5 6 4 5 4 9 5 4 8 4 5 6 4 11 4 6 10 8 3 5 7 7 11 5 5 3 5 MEDIA 6 4,7 6,3 6,9 5,3 5,8 5,4 5,2 3,7 5,4777778 SD 1,826 1,4944 1,8886 2,5144 1,059 2,251 1,43 2,2998 0,823 1,7318098 Grupo

Senil rato 1 rato 2 rato 3 rato 4 rato 5 rato 6 rato 7 rato 8 rato 9 rato 10

1 17 14 20 13 15 15 21 20 14 13 2 15 12 16 11 16 14 18 18 20 13 3 11 14 13 13 10 14 21 18 20 14 4 9 14 12 13 16 12 19 15 22 16 5 16 12 15 11 20 15 18 15 20 15 6 18 8 10 15 21 16 16 16 18 16 7 14 18 10 14 21 16 21 21 12 15 8 13 16 16 10 16 16 18 22 13 18 9 22 15 17 15 16 15 17 22 14 14 10 18 17 15 15 16 15 17 19 14 15 MEDIA 15,3 14 14,4 13 16,7 14,8 18,6 18,6 16,7 15,788889 SD 3,773 2,8674 3,1693 1,8257 3,302 1,229 1,838 2,675 3,653 2,703538

  35 Grade da avaliação das caspases    1 2 3 4 5 6 7 media ratos jovens 50 -75 50-75 50-75 50-75 50-75 50-75 0-25 50-75 ratos orquiectomizados 0-25 0-25 50-75 50-75 50-75 50-75 50-75 50-75 senis 75-100 75-100 75-100 75-100 75-100 75-100 75-100 75-100  

36