İki-gen sistemi oluşturarak tasarım (Tasarım-II)

E.coli XLI-Blue mikroorganzimasına CaCl2 yöntemi ile transforme edilmiştir.

Transformasyon sonucu oluşan kolonilerden plasmid izolasyonları sonucunda gen içeren plasmid elde edilememiştir. Bunun sonucu farklı parametreler değiştirilerek ligasyon tepkimeleri tekrar gerçekleştirilmiştir. İncelenen parametreler Çizelge 4.1’de özetlenmiştir.

Çizelge 4.1 aroA::aroH geninin pUC19 ve pMK4 plasmidlerine ligasyon tepkimesi

Plasmid Ligasyon türü

Gen derişimi (G) (ng/μl)

Plasmid derişimi (V)

(ng/μl) G/V

pUC19 Yapışkan-uç 10.3 7.07 3 (60/20) pUC19 Yapışkan-uç 10.3 7.07 3 (90/30) pUC19 Yapışkan-uç 15.78 10.71 3 (72/24) pUC19 Yapışkan-uç 15.78 10.71 3 (90/30)

pUC19 Küt-uç 15.78 10.71 3 (90/30)

pUC19 Yapışkan-uç 20.43 53.6 3 (120/40) pUC19 Yapışkan-uç 20.43 7.07 5 (100/20) pUC19 Yapışkan-uç 20.43 53.6 2 (80/40) pUC19 Yapışkan-uç 20.43 53.6 3 (50/50)

pUC19 Yapışkan-uç 33.3 22.2 5 (100/20) pUC19 Yapışkan-uç 33.3 22.2 3 (60/20)

pUC19 Yapışkan-uç 33.3 24 3 (144/48) pUC19 Yapışkan-uç 33.3 24 5 (240/48) pMK4 Yapışkan-uç 15.78 23.1 3 (72/24) pMK4 Yapışkan-uç 15.78 23.1 3 (90/30)

pMK4 Küt-uç 15.78 23.1 3 (90/30)

pMK4 Yapışkan-uç 20.43 34.64 3 (60/20) pMK4 Yapışkan-uç 20.43 34.64 3 (50/16.67) pMK4 Yapışkan-uç 20.43 34.64 5 (100/20) pMK4 Yapışkan-uç 20.43 34.64 5 (50/10) pMK4 Yapışkan-uç 26.24 11.53 3 (90/30) pMK4 Yapışkan-uç 26.24 11.53 3 (120/40) pHV1431 Yapışkan-uç 20.43 12.1 5 (120/24) pHV1431 Yapışkan-uç 20.43 12.1 5 (120/17.14)

Tasarım-II’ye göre yürütülen araştırma programının primer tasarımları ve aroA::aroH iki-gen sisteminin oluşturulması, gen derişiminin artırılması, E.coli ve E.coli-Bacillus plasmidlerine klonlama tepkimeleri, transformasyon deney ve bulguları aşağıda verilmiştir

4.1.2.1 Primer tasarımı ve PCR ile gen derişiminin artırılması

aroA ve aroH genlerinin nükleik asit dizinleri ve tasarlanan ileri ve geri primer dizinleri Şekil 4.4 ve 4.5’te verilmiştir.

tgtaa

aaaacccttgaacattgccctcacatcatgtaggatagc ttcatagattactttatcacttaaaagcgtttgggtaat aaagtagagtttttataaaattttttgtatttcagtatt tccatttggaattacttatagtaagatgcatgataacta caaaataaaaaatgaatgtgcagggaaaggatgaaaaaa 1 - atg agc aac aca gag tta gag ctt tta agg 31 - cag aaa gca gac gaa tta aac cta caa att 61 - tta aaa tta atc aac gaa cgc ggc aat gtt 91 - gta aaa gag atc ggt aaa gcg aag gaa gca 121 - cag ggt gtc aac cga ttt gac cct gtc aga 151 - gaa cgc aca atg tta aac aat atc att gaa 181 - aac aat gac ggg ccg ttc gaa aat tca acc 211 - atc cag cac att ttt aaa gag ata ttc aaa 241 - gcc ggt tta gag ctt cag gaa gaa gat cac 271 - agc aaa gcg ctg ctt gtc tcc cgc aag aaa 301 - aaa cct gaa gat aca att gtt gat atc aaa 331 - ggc gaa aaa atc gga gac ggc cag caa aga 361 - ttc att gtc ggc cca tgt gcg gta gag agc 391 - tat gag cag gta gct gaa gtc gct gca gct 421 - gcg aaa aaa caa ggg att aaa att ttg cgc 451 - ggt gga gcc ttt aag cct cgt acg agc cca 481 - tac gat ttc caa ggg ctt ggt gtt gaa ggc 511 - ctt caa att tta aaa cgt gta gcg gat gaa 541 - ttt gat ctg gcg gtt atc agt gaa atc gta 571 - act ccg gct cat atc gaa gaa gcg ctg gac 601 - tac att gat gtc att caa atc gga gcg cgc 631 - aac atg caa aac ttc gaa ttg ctg aaa gcg 661 - gcc ggc gcc gtg aaa aag cca gtg ctt ctg 691 - aag cgc ggt ctt gct gca acg atc tct gaa 721 - ttc atc aat gct gct gaa tac atc atg tca 751 - caa gga aat gac caa att atc ctt tgt gag 781 - cgc gga atc aga aca tat gaa aca gca acg 811 - aga aac acg ctg gat att tca gct gtg ccg 841 - att ttg aaa caa gaa acg cat ttg cca gtc 871 - ttt gtt gat gtt acg cat tca aca ggc cgc 901 - cgt gac ctc ttg ctt ccg aca gct aaa gcc 931 - gct tta gcg atc ggt gct gat ggc gta atg 961 - gct gag gtt cac cct gat ccg tca gtc gca 991 - ctt tct gac tct gct cag caa atg gcg att 1021 - cct gaa ttc gaa aaa tgg ctg aat gaa ctg 1051 - aag cca atg gtg aaa gtc aac gct

taattgaacaatccaaaaggccgccgtgcggcctttttt tatgctttctcgtttatttagttataaaaaccaagtata cgttttcatcatctataaaaacgtgtataatttcatgag aagtaattaaatttgatgaataatgaaaaataatgtaca ctactgacttacgcttacaaatcataaacgacataaatt cggac

aroA FP + SalI : 5’_ gcgtcgacgtaaaaaacccttgaacattgc _3’

aroA RP + aroH : 5’_ aacccaggcttttgtccgaatttatgtcgttatgat _3’

Şekil 4.4 aroA geni için tasarlanan primerler ve nükleotit dizinleri

aaaag

cctgggttatccaagtcaaatcagaaaagagacggaaac ttcggttctcttgaaccgtatgatgaatgataagaaaac ccgtggcgggaagattcagtttattgtgctcaacgaatt agggaaagttgctgatcatacattttccagaaatgaact tgagagctggctgaacaaatggcgattggaggagacatc 1 - atg atg att cgc gga att cgc gga gca act 31 - aca gtt gaa cgg gat act gaa gaa gaa att 61 - tta caa aaa act aaa cag ctg tta gag aaa 91 - atc ata gaa gaa aat cat aca aaa ccg gaa 121 - gat gtt gtt caa atg ctt ctg tcg gct aca 151 - cct gat ttg cac gct gtt ttc ccg gca aaa 181 - gct gtt cgc gag ctt tca gga tgg cag tat 211 - gta ccg gta aca tgt atg cag gaa atg gac 241 - gta aca ggc ggt ctg aaa aag tgc ata aga 271 - gtc atg atg acg gtc cag aca gat gtc cct 301 - cag gat cag atc aga cat gta tat tta gaa 331 - aaa gtt gtc gta ttg agg ccc gat tta tca 361 - ttg aca aaa aat act gaa ttg

taatacgataagaacagcttagaaatacacaagagtgtg tataaagcaattagaatgagttgagttagagaatagggt agcagagaatgagtttagttgagctgagacattatgttt attctacccaaaagaagtctttcttttgggtttatttgt tatatagtattttatcctctcatgccatcttctcattct ccttg

aroH FP+ aroA: 5’_ataaattcggacaaaagcctgggttatccaagt_3’

aroH RP+BamHI : 5’_ ggggatccccagctgttcttatcgtattac _3’

Şekil 4.5 aroH geni için tasarlanan primerler ve nükleotit dizinleri

aroA ve aroH genleri 1. ve 2. PCR tepkimeleriyle Tyapışma=60 ºC , tyapışma, aroA= 180 s ve tyapışma, aroH= 90 s’de gen derişimleri artırılmıştır.

1. ve 2. PCR tepkimeleri ile çoğaltılan aroA ve aroH genleri 3. PCR tepkimesi ile Tyapışma=60 ºC , tyapışma, aroA::aroH= 180 s koşullarında gen derişimi artırılmıştır ve 2252bp uzunluğunda aroA::aroH elde edilmiştir (Çizelge 4.5).

aroA::aroH geni E.coli plasmidi olan pUC19 ve E.coli –Bacillus shuttle plasmid olan pMK4’e farklı gen/plasmid ve gen, plasmid derişimlerinde küt-uç ve yapışkan-uç ligasyon tepkimeleri gerçekleştirilmiştir. Ligasyon tepkme ürünleri E.coli XLI-Blue mikroorganzimasına CaCl yöntemi ile transforme edilmiştir. Transformasyon sonucu

oluşan kolonilerden plasmid izolasyonları sonucunda gen içeren plasmid elde edilememiştir. Bunun sonucu farklı parametreler değiştirilerek ligasyon tepkimeleri tekrar gerçekleştirilmiştir. İncelenen parametreler Çizelge 4.2’de özetlenmiştir.

.

Çizelge 4.2 aroA::aroH geninin pUC19 ve pMK4 plasmidlerine ligasyon tepkimesi

Plasmid Ligasyon türü

Gen derişimi (G) (ng/µl)

Plasmid derişimi (V)

(ng/µl) G/V=3

pUC19 Yapışkan -uç 13.43 32.14 90/30 pUC19 Yapışkan -uç 13.43 32.14 72/24 pMK4 Yapışkan -uç 13.43 69.23 90/30 PMK4 Yapışkan- uç 13.43 69.23 72/24

PUC19 Küt -uç 31.55 12.85 90/30

PMK4 Küt -uç 31.55 15 90/30

pMK4 Yapışkan -uç 6.3 23.09 72/24 pMK4 Yapışkan -uç 6.3 23.09 60/20 pUC19 Yapışkan-uç 6.3 5.36 60/20

Tasarım I ve Tasarım II ‘de iki-gen sistemi büyüklükleri pUC19 büyüklüğüne yakın olması nedeni ile iki tasarımda klonlamaların başarılı olmadığı sonucuna varılmıştır.