İcra Ortamları

Os padrões de bandas em gel de agarose corados com brometo de etídeo para os genes GAPDH, IL-2, IL-1, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL -4, expressos no grupo controle, estão descritos na Figura 9. Os resultados de expressão dos genes IL-2, IL-1, TNF-a, IL -6, IL-10, IFN-? e IL-4, relativa ao gene GAPDH, para os animais do grupo controle estão descritos na Tabela 5 e na Figura 10.

A

B

ANIMAL 1 ANIMAL 2 ANIMAL 3

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 4 ANIMAL 5 ANIMAL 6

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 7 ANIMAL 8 ANIMAL 9

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 10 ANIMAL 11 ANIMAL 12

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 13 ANIMAL 14 ANIMAL 15

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 16 ANIMAL 17 ANIMAL 18

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 19 ANIMAL 20

L A B C D E F G H L A B C D E F G H

Figura 9. Padrão de bandas obtidas em gel de agarose corado com brometo de etídeo, do “ladder” (L) e

dos genes GAPDH (A), IL-2 (B), IL-1ß (C), TNF-a (D), IL-6 (E), IL-10 (F), IFN-? (G), e IL-4 (H), nas amostras de conjuntiva bulbar dos animais (n = 20) que constituíram o grupo controle. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Tabela 5. Valores individuais, médias das relações e erros padrão entre as intensidades das bandas dos

genes (IL-2, IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL-4) e a intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH (GAP), em cada amostra conjuntival coletada dos animais (n = 20) do grupo controle. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Animal IL-2/GAP IL-1/GAP TNF/GAP IL-6/GAP IL-10/GAP IFN/GAP IL-4/GAP

1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 1,22 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0,54 0 0 0 8 0,30 0 0 1,06 0 0 0 9 0 0 0 0,77 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 0 0 14 0 0 0,25 0,60 0 0 0 15 0,46 0 0 2,27 1,14 0 0 16 0,99 0 0 1,03 0,62 0 0 17 0 0 0 0,54 0 0 0 18 0 0 0,30 1,39 0 0 0 19 0 0 0 0,43 0 0 0 20 0 0 0 0,22 0 0 0 Média ± Ep 0,09 ± 0,05(*) 0(*) 0,03 ± 0,02(*) 0,50 ± 0,14 0,09 ± 0,06(*) 0(*) 0(*) (*) Valor estatisticamente menor, quando comparado ao valor de expressão relativa do gene IL-6.

Nas amostras de conjuntiva bulbar dos animais que constituíram o grupo controle, não se observou expressão dos genes IL -1-ß, IFN-? e IL-4. Os genes IL -2, TNF-a e IL-10 foram expressos, porém não houve diferença estatisticamente significativa quando as médias da expressão relativa foram comparadas entre si.

A média da expressão relativa do gene IL-6 mostrou-se significativamente superior (P < 0,05) para os animais do grupo controle, quando comparada às dos outros genes estudados.

Figura 10. Médias e erros padrão dos valores das relações entre as intensidades das bandas dos genes

estudados (IL-2, IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL-4) e a intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH, nas amostras de conjuntiva do grupo controle (GSC). (*) Valor estatisticamente maior quando comparado ao valor de expressão relativa dos outros genes estudados. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Os padrões de bandas em gel de agarose corado com brometo de etídeo para os genes GAPDH, IL-2, IL -1, TNF-a, IL-6, IL -10, IFN-? e IL -4, expressos no grupo cinomose, estão descritos na Figura 11. Os resultados de expressão dos genes IL-2, IL- 1, TNF-a, IL-6, IL -10, IFN-? e IL-4, relativa ao gene GAPDH, para os animais do grupo cinomose, estão descritos na Tabela 6 e na Figura 12.

E x p r e s s ã o g ê n i c a - G S C 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

IL-2 I L - 1 T N F IL-6 I L - 1 0 INF IL-4

G e n e s

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) G S C

*

E x p r e s s ã o g ê n i c a - G S C 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

IL-2 I L - 1 T N F IL-6 I L - 1 0 INF IL-4

G e n e s

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH)

G S C

*

ANIMAL 1 ANIMAL 2 ANIMAL 3

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 4 ANIMAL 5 ANIMAL 6

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 7 ANIMAL 8 ANIMAL 9

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 10 ANIMAL 11 ANIMAL 12

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 13 ANIMAL 14 ANIMAL 15

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 16 ANIMAL 17 ANIMAL 18

L A B C D E F G H L A B C D E F G H L A B C D E F G H

ANIMAL 19 ANIMAL 20

L A B C D E F G H L A B C D E F G H

Figura 11. Padrão de bandas obtidas em gel de agarose corado com brometo de etídeo, do “ladder” (L) e

dos genes GAPDH (A), IL-2 (B), IL-1ß (C), TNF-a (D), IL-6 (E), IL-10 (F), IFN-? (G), e IL-4 (H), nas amostras de conjuntiva bulbar dos animais (n = 20) que constituíram o grupo cinomose. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Tabela 6. Valores individuais e médias das relações entre as intensidades das bandas dos genes

estudados (IL-2, IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL-4) e a intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH (GAP), das amostras conjuntivais coletadas dos animais (n = 20) do grupo cinomose. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Animal IL-2/GAP IL-1/GAP TNF/GAP IL-6/GAP IL-10/GAP IFN/GAP IL-4/GAP

1 0 0 0,30 0 0,54 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0,34 0,31 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0,92 0 0 0 0 0 6 0 0,45 0,90 0,91 1,0 0 0 7 0 0 0,17 0 0,66 0 0 8 0 0 0 0 1,03 0 0 9 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0,46 0 1,03 0 0 11 0 0,83 0,42 0 0 0 0 12 0 0,75 1,0 1,01 1,0 0 0 13 0 0 0 0,47 1,01 0 0 14 0 0 0 0,80 0 0 0 15 0 0,47 0,65 1,34 0 0 0 16 0 0,25 0,39 0,28 0,65 0 0,20 17 0,32 0,40 0,98 0,98 0,97 0,35 0 18 0 0,99 0,53 1,00 0,98 0 0,99 19 0,30 0,42 1,06 1,23 1,21 0,31 0 20 0 0 0 0 1,29 0 1,40 Média ± Ep 0,03 ± 0,02(*) 0,30 ± 0,08 0,34 ± 0,09 0,42 ± 0,12 0,60 ± 0,11 0,03 ± 0,02(*) 0,13 ± 0,03(*) (*) Valores estatisticamente menores quando comparados aos valores de expressão relativa dos genes IL-1ß, TNF-a, IL-6 e IL-10.

Nas amostras de conjuntiva bulbar dos animais que constituíram o grupo cinomose, as médias de expressão relativa dos genes IL-6, IL-10, TNF-a e IL-1ß foram estatisticamente maiores, quando comparados às médias dos genes IL-2, IFN-? e IL -4 (P < 0,05) (Tabela 6 e Figura 12).

Figura 12. Médias e erros padrão dos valores das relações entre as intensidades das bandas dos genes

estudados (IL-2, IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL-4) e a intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH, nas amostras de conjuntiva do grupo cinomose (GPC). (*) Valores estatisticamente maiores quando comparados aos de expressão relativa dos genes IL-2, IFN-?, e IL-4. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

Quando as médias de expressão relativa do gene IL -1ß foram comparadas entre os grupos controle e cinomose, verificou-se expressão estatisticamente maior no grupo cinomose (P = 0,015). As expressões relativas das citocinas TNF -a (P = 0,008) e de IL - 10 (P = 0,016) mostraram-se, igualmente, maiores no grupo cinomose, quando este foi comparado ao grupo controle. Diferenças estatisticamente significativas não foram identificadas, quando os genes IL -2, IL-6, IFN-? e IL-4 foram comparados entre os grupos (Figura 13). E x p r e s s ã o g ê n i c a - G P C 0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8

I L - 2 IL-1 T N F IL-6 I L - 1 0 INF IL-4

G e n e s

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) G P C

*

*

*

*

IFN

Figura 13. Médias e erros padrão dos valores das relações entre as intensidades das bandas dos genes

estudados (IL-2, IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-10, IFN-? e IL-4) e a intensidade da banda do gene de expressão constitutiva GAPDH, nas amostras de conjuntiva dos grupos controle (GSC) e cinomose (GPC). (*) Diferença estatisticamente significativa do gene estudado entre os grupos. Jaboticabal, São Paulo, 2006.

4.4. Correlações

No grupo controle, os sinais oftálmicos não se correlacionaram estatisticamente aos achados à histopatologia. Neste grupo, inflamação aguda foi verificada em 20% dos cães estudados e inflamação sub-aguda em 15%. Estes animais não apresentaram sinais clínicos de quemose, blefarospasmo, hiperemia e secreção ocular. Os cães também apresentaram valores negativos para os testes de rosa Bengala e fluoresceína valores normais do teste lacrimal de Schirmer.

A expressão gênica relativa da IL -6, no grupo controle, foi estatisticamente maior do que os outros genes estudados. Correlação negativa entre a expressão de IL -6 e inflamação aguda foi verificada (q = -0,5, P = 0,02)

No grupo cinomose, a presença de hiperemia, secreção ocular, positividade para os testes de rosa Bengala e fluoresceína e valores reduzidos do teste lacrimal de Schirmer não puderam ser correlacionadas estatisticamente com a presença de inflamação crônica, à histopatologia, porém, clinicamente, a presença destes eventos estava relacionada. Estes animais também apresentaram diminuição da densidade de células caliciformes, presença de queratinização, acantólise e corpúsculos de inclusão.

E x p r e s s ã o G ê n i c a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

IL-2 IL-1 TNF IL-6 IL-10 INF IL-4

G e n e s

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) G S C G P C

*

*

*

E x p r e s s ã o G ê n i c a 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

IL-2 IL-1 TNF IL-6 IL-10 INF IL-4

G e n e s

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) G S C G P C

*

*

*

IFN

Embora as expressões relativas dos genes TNF-a, IL -1ß e IL -10 tenham estado aumentadas no grupo cinomose, quando comparada à expressão dos genes IL -2, IFN e IL-4, apenas o TNF-a foi correlacionado positivamente à presença de inflamação crônica (q = 0,47, P = 0,038).

Os perfis de sinais oftálmicos encontrados nos grupos estudados, assim como de achados histopatológicos e expressão gênica estão dispostos na Figura 14.

Figura 14. Perfis das porcentagens (%) de ocorrência dos sinais oftálmicos e achados histopatológicos e

das médias da taxa de expressão gênica (Citocina/GAPDH) nos grupos controle (GSC) e cinomose (GPC). Jaboticabal, São Paulo, 2006. (+) Correlação positiva entre as variáveis inflamação crônica e expressão de TNF-a no grupo cinomose, (T) correlação negativa entre as variáveis inflamação aguda e expressão de IL-6 no grupo controle.

Expressão Gênica 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

IL-2 IL-1 TNF IL-6 IL-10 INF IL-4

Genes

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) GSC GPC Histopatologia 0 20 40 60 80 100 120 Agud a Sub-aguda Crônica Caliciformes Queratinização Corpúsculos Acantólise Variáveis (%) GSC GPC Sinais Oftálmicos 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Quem ose Blefarospasmo Hiperemia Secre ção

Rosa bengala Flu oresc eína Variáveis (%) GSC GPC Expressão Gênica 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

IL-2 IL-1 TNF IL-6 IL-10 INF IL-4

Genes

Médias da taxa de expressão

(Citocina/GAPDH) GSC GPC Histopatologia 0 20 40 60 80 100 120 Agud a Sub-aguda Crônica Caliciformes Queratinização Corpúsculos Acantólise Variáveis (%) GSC GPC Sinais Oftálmicos 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Quem ose Blefarospasmo Hiperemia Secre ção

Rosa bengala Flu oresc eína Variáveis (%) GSC GPC + + T T

5 DISCUSSÃO

A ceratoconjuntivite seca (CCS) é uma enfermidade freqüentemente encontrada nos cães. Ela é caracterizada por déficit lacrimal, que enseja danos às superfícies corneal e conjuntival (BARRERA, 1992; BEGLEY et al., 2003; KUNERT et al., 2002; PFUGFELDER et al., 2000). Nos últimos 25 anos, não há enfermidade em córnea e superfície ocular que tenha sido mais estudada que a CCS (PFLUGFELDER et al., 2000).

Neste trabalho, estudaram-se animais com CCS secundária à cinomose. Os resultados do teste da lacrimal Schirmer foram inferiores no grupo cinomose, comparativamente ao controle. A diminuição significativa dos valores do Schirmer reproduz o que fora mostrado por GREEN et al. (1989), KASWAN et al. (1983), KASWAN et al. (1985), MARTIN (1999) e TISHLER et al. (1998), que descreveram a cinomose como uma doença viral que acomete a glândula lacrimal, induzindo a quadros de inflamação com CCS secundária.

Outros sinais oftálmicos foram evidenciados neste experimento, tais como hiperemia conjuntival e secreção ocular, comuns na CCS. A presença deles foi maior no grupo cinomose, quando comparado ao grupo controle. Autores como KUNERT et al. (2002), LUBNIEWSKI & NELSON (1990), SALISBURY et al. (1995) e WILCOCK (1993) reportaram-se a estes, entre outros sinais oftálmicos, como decorrentes do déficit lacrimal.

A xeroftalmia causa não apenas desconforto ocular, mas também desencadeia alterações histopatológicas à córnea e conjuntiva (BARRERA, 1992; BEGLEY et al., 2003; KUNERT et al., 2002; PFUGFELDER et al., 2000), por aumento da osmolaridade lacrimal, dessecação e pobre lubrificação da superfície ocular (BARABINO et al., 2004; MARSH & PFUGFELDER, 1999; RAPHAEL et al., 1988).

A realização da histopatologia permitiu verificar alterações na conjuntiva bulbar dos cães da pesquisa. O procedimento pôde ser realizado mediante instilação de colírio anestésico, como o fora por RALPH (1975). As biópsias foram realizadas no quadrante

superonasal, a aproximadamente 5 mm do limbo, como proposto por KUNERT et al. (2002) e PFLUGFELDER et al., (1997).

No grupo cinomose, a presença de células, notadamente macrófagos,

neutrófilos, linfócitos e plasmócitos, ratificaram a ocorrência de exsudação inflamatória. Evidências de que a inflamação participa na patogênese da ceratoconjuntivite seca são cada vez mais reportadas (KUNERT et al., 2000; KUNERT et al., 2002; MARSH & PFUGFELDER, 1999; PFLUGFELDER et al., 1990; PFUGFELDER et al., 2000; RAPHAEL et al., 1988; TURNER et al., 2000). Inflamação crônica foi encontrada em 55% dos animais, os quais apresentavam infiltrado inflamatório mononuclear, com predomínio de linfócitos e plasmócitos. KUNERT et al. (2000), KUNERT et al. (2002), PFLUGFELDER et al. (1990), PFUGFELDER et al. (2000), POWER et al. (1993), RAPHAEL et al. (1988) e RIVAS et al. (1992) reportaram a predominância de linfócitos, especificamente os linfócitos T, de permeio a plasmócitos, no epitélio conjuntival de pacientes com CCS. RIVAS et al. (1992) afirmaram, ainda, que quando a inflamação se torna crônica, decorre importante aumento no percentil de linfócitos. PFLUGFELDER et al. (2000) relataram que a inflamação crônica da superfície ocular exerce papel decisivo na patogênese da CCS. Os autores afirmaram, ainda, que a inflamação crônica decorre do déficit lacrimal. A correlação entre os valores do teste lacrimal de Schirmer e a presença de inflamação não pôde ser estatisticamente confirmada. Não obstante, os animais do grupo cinomose, que apresentaram valores reduzidos do teste lacrimal de Schirmer, mostraram maior incidência de inflamação crônica.

No grupo controle, 20% dos animais apresentaram inflamação aguda, com predominância de neutrófilos e raros eosinófilos. Em 15% dos cães, decorreu inflamação sub -aguda, com presença de células mono e polimorfonucleares. Ao exame oftálmico, todavia, os animais que compuseram este grupo não apresentaram sinais clínicos sugestivos de inflamação. Segundo RIVAS et al. (1992), correlação entre a intensidade da inflamação e os sinais clínicos oftálmicos não pode ser estabelecida. Os autores relataram que irritantes locais e estados alérgicos podem estar presentes em

animais sem alterações oftálmicas visibilizáveis, contribuindo para um quadro histopato lógico de inflamação.

Na CCS, a inflamação crônica na superfície ocular pode induzir a uma metaplasia escamosa. A presença de acantólise, queratinização, ingurgitamento de

células epiteliais e degeneração epitelial encontrados no grupo cinomose

caracterizaram um quadro de metaplasia escamosa, como resultado do déficit lacrimal na conjuntiva, à similitude do que fora mostrado em pesquisas de outros autores (KUNERT et al., 2002; MARSH & PFUGFELDER, 1999; PFLUGFELDER et al., 1990; PFLUGFELDER et al., 1997; RALPH, 1975; RAPHAEL et al., 1988; RIVAS et al., 1992). Segundo PEIFFER et al. (1998) e WILCOCK (1993), em resposta à irritação crônica da superfície ocular decorrente do déficit lacrimal, a conjuntiva, não queratinizada, sofre metaplasia escamosa, passando a ser identificada como um epitélio escamoso

estratificado queratinizado. Em nosso experimento, em 25% dos animais, à

histopatologia, houve queratinização e em 60% deles acantólise, ratificando o que fora encontrado na literatura.

PFUGFELDER et al. (1990) verificaram forte correlação entre a exsudação inflamatória e a metaplasia escamosa da conjuntiva bulbar. Tal correlação não foi estatisticamente identificada no presente estudo, entretanto, no grupo cinomose, 80% dos animais exibiram inflamação com sinais histopatológicos de metaplasia escamosa, com queratinização, acantólise ou ambos.

Outro evento que se associa à metaplasia escamosa é a perda de células caliciformes (BARABINO et al., 2004; KUNERT et al., 2002; MARSH & PFUGFELDER, 1999; PFLUGFELDER et al., 1990; PFLUGFELDER et al., 1997; RALPH, 1975; RAPHAEL et al., 1988; RIVAS et al., 1992). De consoante com o que fora descrito por esses autores, os dados obtidos na presente pesquisa mostraram que a densidade de células caliciformes encontrou-se diminuída na conjuntiva bulbar dos animais do grupo cinomose, comparativamente ao grupo controle. Células caliciformes produzem mucina, que é um dos componentes da lágrima (KESSING, 1968). RIVAS et al. (1992) afirmaram que a densidade diminuída das células caliciformes poderia indicar a severidade da doença ocular. PFLUGFELDER et al. (2000) relataram que a produção

reduzida de muco também está associada à patogênese da CCS. Nos cães do grupo cinomose, cujos valores do Schirmer estavam diminuídos, havia densidade reduzida de células caliciformes, maior acantólise e queratinização, e presença de células inflamatórias.

O emprego do rosa Bengala na superfície ocular é oportuno para a avaliação da severidade das lesões (DANJO et al., 1994). BARABINO et al. (2004) e TSENG (1994) afirmaram que o corante se fixa às células epiteliais conjuntivais e corneais pouco ou não protegidas pelo filme lacrimal. Em 70% dos animais do grupo cinomose, houve impregnação, de moderada a severa, pelo corante. Os animais do grupo controle não apresentaram sinais de impregnação. Correlação entre os escores do teste de rosa Bengala e a severidade das lesões conjuntivais, à histopatologia, puderam ser clinicamente identificadas, porém, à estatística, tal não pôde ser comprovada.

Há como admitir que o vírus, por ação direta sobre a glândula lacrimal, tenha desencadeado a diminuição da secreção lacrimal e perda da densidade de células caliciformes, por quebra da homeostase da superfície lacrimal, com diminuição da produção de muco. Uma vez que o muco diminui os efeitos da evaporação sobre a porção aquosa da lágrima, sua redução pode ter contribuído sobremaneira para a ocorrência das alterações, à histopatologia, vistas no presente estudo, corroborando DANJO et al. (1994), PFLUGFELDER et al. (2000) e RIVAS et al. (1992).

A fluoresceína é um corante vital hidrossolúvel utilizado para se avaliar a integridade do epitélio corneano (BARABINO et al., 2004). O teste foi positivo em 35% dos cães do grupo cinomose. A presença de úlceras corneais nestes animais corrobora o que fora descrito por MOORE (1999). Segundo o autor, na CCS, o déficit lacrimal e a inflamação crônica podem desencadear doença corneana progressiva, com malácia estromal, uma vez que a nutrição e a lubrificação corneais estão comprometidas.

Na cinomose, corpúsculos de inclusão do morbilivirus podem ser encontrados no epitélio conjuntival (JEGOU & LIOTET, 1991; MARTIN & STILES, 1998; MOORE & NASISSE, 1998; RAPP & KÖLBL, 1995; RENDER et al., 1982). Na presente pesquisa, 25% dos animais com CCS, portadores de cinomose, submetidos ao procedimento de biópsia, apresentaram, à histopatologia, corpúsculos permeando o epitélio conjuntival,

de característica basofílica e formato arredondado, à similitude do que fora descrito por JEGOU & LIOLET (1991). Embora este achado tenha sido encontrado em 25% e não em 100% dos animais da presente pesquisa, por sua simplicidade operacional, há como admitir que o procedimento possa ser realizado rotineiramente, conferindo maior acurácia ao diagnóstico da cinomose.

Grânulos de melanina, entremeados às células epiteliais e ao tecido conjuntivo frouxo, puderam ser observados em ambos os grupos, a exemplo do que fora mostrado por BOLZAN et al. (2005), quando avaliou, à citologia conjuntival por impressão e à histopatologia, conjuntivas de animais normais.

Segundo KASWAN et al. (1984), correlação entre achados clínicos e

histopatológicos pôde ser verificada em apenas 8% dos casos (n = 33). DANJO et al. (1994) não encontraram correlação entre os achados histopatológicos e a severidade das lesões. No presente estudo, os resultados obtidos foram comprobatórios. Achados clínicos e histopatológicos não se correlacionaram estatisticamente.

A expressão gênica foi avalizada pelo método RT-PCR semi-quantitativo, conforme descrito por COLE et al. (2003), DEGEN et al. (2005), KING et al. (2000), LAU et al. (2006), LEE et al. (1999), RUDNER et al. (2000), THAKUR et al. (2002) e XUE et al. (2003). A RT-PCR semi-quantitativa normaliza a quantidade relativa do produto da PCR, derivado do DNA complementar gerado a partir do RNA extraído da amostra tecidual, com a de um gene de expressão constitutiva. Empregou-se o GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase), um gene expresso constitutivamente em inúmeros tecidos, como proposto por CHAMIZO et al. (2001), DEGEN et al. (2005), HEGERMANN et al. (2003), LAU et al. (2006) e LEE et al. (1999). Com este método de avaliação, gerou-se um valor de abundância relativa, expresso como citocina/GAPDH, o que permitiu a quantificação relativa dos genes estudados. O GAPDH foi também utilizado como controle positivo de referência, para a variação de concentração e de qualidade do RNA (CHAMIZO et al., 2001). Concentração e qualidade do RNA poderiam interferir sobremaneira na reação de transcrição reversa e no processo de amplificação, fornecendo falsas diferenças na expressão de uma citocina específica,

entre as amostras estudadas (CHAMIZO et al., 2001; GRÖNE et al., 1996; GRÖNE et al., 1998).

O envolvimento de citocinas na destruição da superfície ocular na CCS tem sido cada vez mais estudado (DURSUN et al., 1994; KUNERT et al., 2002; PFLUGFELDER et al., 1999; PFLUGFELDER et al., 2002). Na cinomose, GRÖNE et al. (1998) relataram expressão elevada de IL-1, IL-6, IL-12, TNF-a e TGF , no sangue de cães infectados. Estudo adjunto, realizado com infecção pelo paramixo vírus em camundongos, mostrou aumento da expressão de citocinas, tais como TNF-a, IL-6 e IFN-?, e expressão reduzida de IL-4 e IL-10 (KHUTH et al., 2001).

Na presente pesquisa, a expressão e a semi-quantificação de citocinas na conjuntiva bulbar foram avaliadas em animais aparentemente normais, sem sinais oftálmicos, e em cães com ceratoconjuntivite seca, portadores de cinomose. Os resultados indicaram que os níveis aumentados de citocinas inflamatórias no epitélio conjuntival podem exercer papel decisivo na patogênese da CCS.

Para avaliação das citocinas IL -1ß, IL-2, IL -4, IL-6, IL -10, TNF-a e IFN-?, utilizaram-se primers previamente descritos por CHAMIZO et al. (2001) e HEGERMANN et al. (2003). Durante otimização das reações, obteve-se expressão das citocinas IL -1ß, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-a e IFN-? com as mesmas condições de amplificação, anelamento e extensão descritos pelos autores, porém, para a IL-4, com a temperatura de anelamento de 60°C (CHAMIZO et al., 2001), não se obteve qualquer expressão. Entretanto, à temperatura de 45°C, obteve-se a expressão desta interleucina. As citocinas estudadas foram escolhidas com base nos achados da literatura referentes à relevância destas na patogênese da ceratoconjuntivite seca e de outras enfermidades da superfície ocular.

Com a obtenção dos valores de expressão gênica relativa das citocinas estudadas para cada animal, observou-se que , no grupo cinomose, a IL-6 (0,42) foi significativamente expressa, comparativamente à expressão das outras citocinas. Níveis elevados de IL -6 já foram relatados no epitélio conjuntival (BADOUIN et al., 1997; JONES et al., 1994; RAPHAEL et al., 1988) e no filme lacrimal (PFLUGFELDER et al., 1999; TISHLER et al., 1998) de seres humanos com CCS. A IL-6 é uma citocina

pró-inflamatória que atua tanto na imunidade inata quanto na adaptativa (ABBAS & LICHTMANN, 2005; FUJIWARA et al., 2003). Ela é, ainda, uma citocina multifuncional que atua concomitantemente com outras citocinas, como a IL-10, e possui atividade reguladora inibindo a produção de IL -1 e TNF (COLE et al., 1999; SANTOS-GOMES et al., 2002). Sua gênese pode influenciar inúmeras atividades imune -mediadas no olho (COLE et al., 1999). A IL -6 parece exercer função decisória na regulação do recrutamento de leucócitos para a superfície ocular, controlando a expressão de ICAM- 1 (COLE et al., 2003; HOBDEN et al., 1999). O recrutamento rápido e efetivo de células polimorfonucleares para a superfície ocular aparenta exercer papel protetor e é dependente da produção, em níveis satisfatórios, de IL-6 (COLE et al., 2003).

De acordo com TURNER et al. (2000), na CCS, a expressão de IL -6 elevou-se, em olhos de seres humanos com xeroftalmia, quando comparada à de olhos normais. Na presente pesquisa, o mesmo não pôde ser confirmado. No grupo controle, observou-se, também, expressão elevada de IL -6 (0,50 - valor de expressão relativa), comparativamente a expressão reduzida ou nula das demais citocinas estudadas. Segundo COLE et al. (1999) e CUBITT et al. (1995), a IL -6 é produzida constitutivamente em níveis reduzidos pelas células da córnea, o que capacita esta estrutura a elevar, rapidamente, níveis desta interleucina. Tal condição poderia sugerir que a IL-6 estaria também presente , de forma constitutiva , na conjuntiva bulbar, justificando a sua expressão também no grupo controle. Condição adjunta , que justificaria níveis elevados de IL -6 na conjuntiva de pacientes sem alterações oftálmicas detectáveis ao exame clínico, foi a ocorrência de células inflamatórias em 35% dos animais do grupo controle (inflamação aguda em 20% e sub-aguda em 15%). Neutrófilos polimorfonucleares, presentes em quadros de exsudação aguda e sub- aguda, são os primeiros a migrar para o local agredido. SIQUEIRA & DANTAS (2000) relataram que a IL-6 é um dos mediadores inflamatórios indutores desta migração.

Belgede Gebze’de aşıklık geleneği (sayfa 38-42)