İbadetlerde Karşılaşılan İletişim Engellerine Dair Bulgular

Um dos eventos mais importantes, relatados durante a indução do oncogene RET/PTC3 em células foliculares tiroidianas in vitro é a redução da expressão de genes específicos tiroidianos. Neste estudo investigamos o efeito do tratamento com alta concentração de iodo na expressão de genes relacionados com a função tiroidiana durante a ativação oncogênica da tiróide, analisamos a expressão de mRNA de Nis, Tshr, Tg e Tpo (Tabela 4 e Figura 13). As células do grupo Io, tratado com 10-3M de NaI, apresentaram uma redução da expressão de todos os genes analisados já em 48 horas de tratamento (Nis: 13% ; Tshr: 26% ; Tg: 70% ; Tpo: 6%), com restabelecimento de todos os genes em 120 horas. A indução do oncogene RET/PTC3, reduziu a expressão de Nis, já em 24 horas de tratamento (14%), efeito observado até 120 horas, na qual chegou a uma redução de 81%. Um resultado semelhante foi observado na expressão de Tshr (43%) e Tg (88%) e Tpo (61%).

Nas células RET/PTC3-I a expressão de Nis apresentou um grande aumento após 48 horas (93%), este aumento se sustenta até 72 horas, porém diminuiu 33% em 120 horas de tratamento, quando comparada ao grupo RET/PTC3 (Figura 13A). Resultados semelhantes, porém em menor intensidade, foram observados na expressão de mRNA de Tshr (24 horas: 23% de aumento e 72 horas: 17% de diminuição) e Tpo (48 horas: 16% de aumento e 72 horas: 13% de diminuição) como mostrado nas Figuras 12B e 12C. Como o observado na Figura 12D, a expressão Tg de diminui 80% em 48h, porém em 72 horas a diminuição se limita a 12% e em 120 horas de tratamento não há diferença quando comparado ao grupo tratado com DOX.

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Tabela 4 - Resultados numéricos da análise da expressão de genes específicos tiroidianos. Resultado da expressão de mRNA utilizando primers específicos para os genes selecionados por reação de PCR quantitativo. A análise foi feita utilizando a planilha Qgene.As médias obtidas referem-se a três ensaios realizados independentemente em triplicatas.

Nis Tshr Tg Tpo Tempo (horas) CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3- I CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3- I CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3- I CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3 -I 24h 4,28±0,22 4,28±0,29 3,69±0,16 3,63±0,26 1,5±0,061 1,5±0,09 1,3±0,064 1,6±0,06 17,60±0,66 13,00±0,85 14,80±0,62 13,80±0,14 1,5±0,06 1,5±0,09 1,3±0,06 1,6±0,06 48h 4,92±0,14 4,30±0,13 2,00±0,23 3,86±0,28 1,2±0,037 0,9±0,01 0,9±0,070 0,8±0,05 15,84±0,54 4,83±0,70 8,41±0,24 8,45±0,14 1,2±0,03 0,9±0,01 0,9±0,07 0,8±0,05 72h 5,49±0,16 3,90±0,25 1,37±0,11 2,00±0,08 1,5±0,10 1,1±0,09 0,9±0,080 0,8±0,04 19,60±1,13 13,80±0,79 5,02±0,22 2,37±0,21 1,5±0,10 1,1±0,09 0,9±0,08 0,8±0,04 120h 5,30±0,17 4,90±0,13 1,00±0,09 0,67±0,03 1,5±0,06 1,5±0,02 0,9±0,019 0,8±0,01 22,80±0,92 14,30±1,17 2,75±0,14 3,16±0,23 1,5±0,06 1,5±0,02 0,9±0,02 0,8±0,02

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Figura 13 - Efeito do tratamento com alta dose de iodo na expressão de genes específicos tiroidianos em células com a indução do oncogene RET/PTC. Expressão gênica de Nis(A), Tshr (B), Tpo (C) and Tg (D) normalizadas em relação ao gene referência (RPL19), em células PTC3-5 controle (CTR), tratadas com 10- 3_{M de NaI (Io), com indução do oncogene RET/PTC3}

(RET/PTC3) e com indução do oncogene concomitante ao tratamento com 10-3_{M de NaI (RET/PTC3-I) durante 24, 48,}

72h e 120horas. A linha basal refere-se à quantificação relativa da expressão de mRNA no tempo Zero. Resultados de três experimentos realizados em triplicatas. * P < 0.05 vs. Co, ** P < 0.05 vs. RET/PTC3. Nis 24 48 72 ₁₂0 0 2 4 6 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * * * * * * ** ** ** ** horas Tshr 24 48 72 ₁₂0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * * _* * * ** ** ** horas Tpo 24 48 72 ₁₂0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * * * * * ** ** ** horas Tg 24 48 72 ₁₂0 0 5 10 15 20 25 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * * * * * * * * ** ** ** horas A D B C

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A observação dos níveis proteicos de Nis e Tshr comprovaram o observado na expressão gênica. Observamos que o grupo Io apresentou redução na expressão proteica de Nis e Tshr em 48 horas (Nis: 19%; Tshr: 23% e 27%), e essa expressão está reduzida também em 72 horas (Nis: 8%; Tshr: 31% e 19%). Da mesma forma, no grupo RET/PTC3, a indução do oncogene revelou, também, a redução da expressão proteica de Nis e Tshr em 48 (Nis: 17%; Tshr: 18% e 15%) e 72 horas (Nis: 20%; Tshr: 38% e 15%). Contudo, o grupo RET/PTC3-I apresentou a recuperação da expressão de ambas as proteínas em 48 horas (Nis: 19%; Tshr: 14% e 26%). Interessantemente no grupo RET/PTC3-I em 72horas de tratamento há uma queda acentuada na expressão de Tshr (19% e 21%), enquanto Nis permanece aumentado (25%) (Figura 14).

Tabela 5 - Resultados numéricos da análise da expressão de proteínas específicas tiroidianas. Resultado da expressão proteica utilizando anticorpos específicos para Nis e Tshr. A análise foi feita utilizando o software Scion Image para quantificação das bandas. As médias obtidas referem-se a dois ensaios realizados independentemente em duplicatas. Tempo (horas) CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3- I Nis 0,82±0,08 0,66±0,01 0,68±0,03 0,81±0,05 Tshr120(Kda) 0,65±0,02 0,50±0,04 0,54±0,00 0,61±0,06 48 Tshr60(Kda) 0,83±0,03 0,60±0,01 0,70±0,03 0,88±0,05 Nis 1,73±0,01 1,59±0,01 1,39±0,11 1,73±0,04 Tshr120(Kda) 1,52±0,02 1,04±0,02 0,94±0,07 0,76±0,02 72 Tshr60(Kda) 1,63±0,04 1,32±0,04 1,38±0,05 0,09±0,03

60 85Kda Tshr - - + + - - + + - + - + - + - + Iodine DOX 48h 72h Nis tubulina 40Kda 120Kda 60Kda A B C Nis rTSH 120 rTSH 60 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * ** ** ** * * * * * p ro te ín a /αααα -t u b u li n a Nis Tshr 120 Tshr 60 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 CTR Io RET/PTC3 RET/PTC3-I * ** ** ** ** ** * * * * * ** p ro te ín a /αααα -t u b u li n a

Figura 14 - Efeito do tratamento com alta dose de iodo na expressão de proteínas específicas tiroidianos de células com a indução do oncogene RET/PTC3: Gel representativo da expressão proteica de Nis, Tshr e α-tubulin em células PTC3-5 com indução do oncogene RET/PTC3 na presença de doxiciclina (1 g/ml) e NaI (10-3_{M) durante 48 e 72h por Western Blotting (A). Esquema}

quantitativo da expressão protéica de NIS (85Kda) e rTSH (120Kda e 60Kda) em relação a -tubulina em 48 horas de tratamento nos grupos CTR, Io, RET/PTC3 e RET/PTC3-I (B). Representação gráfica da expressão protéica de NIS (85Kda) e rTSH (120Kda e 60Kda) em relação a -tubulina em 72 horas de tratamento nos grupos CTR, Io, RET/PTC3 e RET/PTC3-I (B). Resultados representativos de três experimentos realizados em duplicatas. * P < 0.05 vs. CTR, ** P < 0.05 vs. RET/PTC3.

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5DISCUSSÃO

O iodo é um dos principais elementos de regulação tiroidiana, tanto seu alto quanto seu baixo consumo podem levar a severas alterações de produção hormonal tiroidiana e metabolismo da célula folicular (Nagataki S et al., 1991; Farwell et al., 2001). Os efeitos moleculares do consumo excessivo de iodo na população mundial, assim como o efeito do excesso de iodo na tumorigênese tiroidiana permanecem pouco esclarecidas.

Neste estudo mostramos o efeito do tratamento com alta dose de iodo na célula folicular tiroidiana durante a ativação oncogênica, utilizando um sistema de indução controlada do oncogene RET/PTC3, a linhagem PCCl3 com indução controlada do oncogene RET/PTC3 se torna uma poderosa ferramenta nos estudos dos mecanismos moleculares de tumorigênese tiroidiana. A via de sinalização MAPK clássica está diretamente relacionada ao desenvolvimento de carcinoma papilífero de tiróide, sendo as mutações nos genes RAS e BRAF e o rearranjo RET/PTC as alterações genéticas mais prevalentes no câncer tiroidiano (Grieco et

al., 1990; Namba et al., 1990; Kimura et al., 2003; Fusco et al., 2007). A ativação do

oncogene RET/PTC3 altera os aspectos morfológicos das células foliculares tiroidianas in vitro (Wang et al., 2003), sendo que o tratamento com alta dose de iodo mantêm os níveis de expressão do oncogene RET/PTC3 e não altera as mudanças morfológicas causadas pela indução do oncogene (Figura 8 e 9).

Na ausência da indução do oncogene notamos o efeito inibitório da alta dose iodo na proliferação de células normais foi transitório e observado no período entre 24 horas e 72 horas de tratamento, efeito vinculado ao efeito auto-regulatório do excesso de iodo. Porém, após 120 horas ocorre a recuperação da capacidade proliferativa, indicando estar vinculada ao escape do efeito auto-regulatório da célula tiroidiana, esse fenômeno foi observado por outros autores (Nagataki S et al., 1991; Leoni, 2007).

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Wang e colaboradores mostraram que a indução do oncogene RET/PTC3 aumenta a síntese de DNA em célula folicular de rato, assim como está associado à morte celular por instabilidade genômica (Wang et al., 2003). Constatamos que as células com ativação de RET/PTC3 apresentam uma notória diminuição no número de células, com redução da viabilidade celular no decorrer do tempo de cultivo. Porém, esta é ainda mais acentuada nas células submetidas a tratamento com alta dose de iodo concomitantemente à ativação de RET/PTC3, entretanto, sem a alteração no número de células mortas, indicando que a redução da proliferação de células foliculares com ativação de RET/PTC3 pela alta concentração de iodo não é influenciada pela morte celular (Figura 10).

A ativação sustentada da cascata de sinalização MAPK tem como conseqüência o aumento na fosforilação da proteína ERK, e aumento da transcrição de genes relacionados ao ciclo celular (Santoro et al., 1992; Santoro et al., 1993; Kimura et al., 2003; Soares et al., 2003; Frattini et al., 2004). A ativação do oncogene RET/PTC3 apesar de não promover o aumento da expressão proteica de Braf e Erk, induz o aumento da fosforilação de Erk e de Ret, e esse efeito foi revertido pelo tratamento com alta dose de iodo. O tratamento com alta dose de iodo atenua a fosforilação de Erk, mostrando que a ativação da via MAPK é regulada negativamente pela alta dose de iodo durante a ativação oncogênica em células foliculares tiroidianas. O tratamento com alta concentração de iodo ainda diminui a fosforilação de Ret, mesmo que sem alterar a expressão gênica de RET/PTC3, indicando que o iodo pode atenuar a ativação de RET. Interessante ressaltar que este efeito não é observado em célula folicular normal tratada com alta concentração de iodo (Figura 11).

Em célula folicular tiroidiana, estudos demonstraram tanto o aumento quanto a inibição da proliferação celular tem a participação de diferentes fatores de crescimento (Kimura et al., 2001). A constatação de que níveis de TGFβ aumentam sob tratamento com alta concentração de iodo em cultura de células FRTL-5 de tiróide é indicativa do envolvimento deste fator na inibição da proliferação destas células pelo tratamento com alta concentração de iodo (Cowin et al., 1992; Yuasa et

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al., 1992). Observamos um aumento significativo na expressão gênica de TGFβ nas

células PTC3-5 tratadas com alta concentração de iodo, sem a indução do oncogene RET/PTC3 (Figura 12).

Outros estudos mostraram que TGFβ quando introduzido no meio de cultura de células foliculares normais de tiróide de diversos animais, induz uma potente inibição da proliferação celular (Morris et al., 1988; Cirafici et al., 1992; Pang et al., 1992). No entanto, cultura primária derivada de carcinoma papilífero tratada com TGFβ apresenta resposta variável na proliferação desde queda até mesmo estímulo da proliferação (Schulte et al., 2001; Bravo et al., 2003). Nas células com indução do oncogene RET/PTC3 observamos um aumento significativo na expressão gênica de TGFβ, em contrapartida, uma grande redução na expressão de Smad4, importante membro da cascata de sinalização TGFβ. Esses dados indicam que apesar do aumento da expressão de TGFβ em células com ativação oncogênica, a via de sinalização correspondente poderia estar comprometida.

Recentemente, observamos um aumento na expressão de Smad7, inibidor da via TGFβ, em carcinoma papilífero e carcinoma anaplásico de tiróide. Indicando que essa via pode estar sendo regulada negativamente durante a oncogênese da tiróide, e ainda que a inibição do efeito de TGFβ está diretamente relacionada à patogênese de carcinomas de tiróide (Cerutti et al., 2003). O tratamento com alta concentração de iodo aumenta a expressão de TGFβ e Smad4 e atenua a expressão dos genes inibitórios à via TGFβ (Smad7), indicando que esta via é potencialmente restaurada pelo tratamento com alta concentração de iodo em células com indução de RET/PTC3 (Figura 12). Estudos recentes mostraram em células normais de tiróide com ativação de K-Ras o restabelecimento da via TGFβ levou a redução da migração e aderência de células com potencial altamente maligno (Nicolussi et al., 2006). Nossos dados indicam que a recuperação da expressão de TGF , Smad4 e a diminuição da expressão da Smad inibitória, Smad7, podem restabelecer a responsividade à via TGFβ nas células com indução do oncogene RET/PTC3.

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Evento este que poderia estar envolvido com a redução da proliferação das células tiroidianas com indução de RET/PTC3 tratadas com alta concentração de iodo.

A célula folicular tiroidiana é caracterizada pela expressão de genes específicos cujo produto esta envolvido com a fisiologia normal tiroidiana (Nis, Tshr, Tpo, Tg ) (Kimura, 2007). Observamos que em 24 a 72 horas o efeito autoregulatório do iodo induz a redução transitória da expressão gênica de Nis, Tshr, Tpo, Tg, sendo que em 120 horas observa-se uma recuperação da expressão destes genes, esse evento é vinculado ao escape do efeito regulatório do iodo na célula folicular tiroidiana (Corvilain et al., 1988; Eng et al., 2001).

Uma característica bem conhecida dos carcinomas de tiróide é a perda da expressão de genes específicos da função tiroidiana (Nis, Tshr, Tpo e Tg), muitos autores relatam que a ativação de RET/PTC3 e BRAFV600E em células foliculares tiroidianas reduz a expressão desses genes tiroidianos (Santoro et al., 1993; Knauf et

al., 2003; Wang et al., 2003; Liu et al., 2007).

Nis é indispensável no transporte do iodeto para o interior do tirócito, é um dos principais marcadores de diferenciação da célula folicular tiroidiana (Dohan, Carrasco, 2003). A perda da expressão de Nis é um evento bem relatado durante a tumorigênese tiroidiana (Santoro et al., 1993; Wang et al., 2003; Mitsutake et al., 2006). Observamos que a indução do oncogene RET/PTC3 reduz drasticamente a expressão de mRNA e proteína Nis. Interessantemente, o tratamento com alta concentração de iodo simultâneo à ativação do oncogene RET/PTC3 leva ao aumento transitório tanto da expressão mRNA quanto da expressão proteica de Nis (Figura 13 e 14), indicando a manutenção do transporte de iodo para dentro da célula folicular durante esse evento.

A regulação da expressão de Nis depende da integridade da via de sinalização Tsh-Tshr-cAMP (Kogai et al., 1997). O Tsh é o principal hormônio regulador da função tiroidiana, sua interação com seu receptor (Tshr), ativa a adenil ciclase as vias de sinalização por AMPc (Vassart et al., 1992). Observamos que a ativação de RET/PTC3 reduz a expressão de mRNA de Tshr. No entanto, esse efeito

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pode ser contornado pelo tratamento com alta dose de iodo, transitoriamente em 72 horas, tanto na expressão de mRNA quanto na expressão proteica de Tshr, que está diminuída em 72 horas de tratamento (Figura 13 e 14). O iodo estaria mantendo a resposta ao efeito do Tsh durante a ativação precoce do oncogene RET/PTC3. Apesar do aumento na expressão gênica de rTSH, observamos a redução na proliferação das células tratadas com alta dose de iodo. Esses dados indicam que mecanismos independentes de TSH-TSHr-AMPc podem influenciar no efeito do iodo na ativação oncogênica tiroidiana.

Após a internalização o iodo é levado à membrana apical celular, a organificação do iodo é controlada pela enzima Tpo, que atua pela via catalítica dependemente de H2O2 (Alexander, 1977). A etapa de organificação do iodo é crucial na síntese hormonal tiroidiana e fundamental para o funcionamento da glândula tiróide (Vaisman et al., 2004). Devido a perda de expressão em tecido tumoral tiroidiano, Tpo é um marcador da transformação maligna tiroidiana (Matsuo

et al., 2004). A indução do oncogene RET/PTC3 diminuiu a expressão de mRNA de Tpo, um evento observado anteriormente por outros autores (Santoro et al., 1993).

De maneira geral o tratamento com alta dose de iodo mantêm os níveis da expressão de mRNA de Tpo, sugerindo que o iodo preserva a diferenciação da célula folicular tiroidiana durante a ativação oncogênica (Figura 13).

Na molécula de Tg estão os principais componentes dos hormônios tiroidianos. Apesar de Tg não ser um potencial marcador tumorigênico (Pacini, 2002). Observamos que a ativação de RET/PTC3 reduz a expressão de mRNA de Tg, esse evento foi relatado por outros autores (Knauf et al., 2003). O tratamento com iodo, ao contrário do observado na expressão dos outros genes analisados (Nis, Tshr e Tpo), diminui ainda mais a expressão de Tg (Figura 13).

O excesso de iodo apresenta efeitos atenuantes na perda da expressão dos genes essenciais para a manutenção da fisiologia tiroidiana, que não se sustentam ao longo do tratamento, indicando um atraso transitório na perda da função tiroidiana durante a ativação do oncogene RET/PTC3, além disso, mostramos que o iodo também pode agir como inibidor da via MAPK, inibindo a ativação de RET e

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resultando na redução de pErk. Recentemente, um estudo com a droga U0126, inibidora da via MAPK mostra que além de reduzir a expressão de pErk, ocorre a recuperação da expressão de genes tiroidianos em PTC, entre os quais Tshr e Nis (Liu et al., 2007). Estes efeitos são semelhantes aos observados em células com ativação de RET/PTC3 tratadas com alta dose de iodo.

O tratamento agudo com alta dose de iodo é uma das medidas profiláticas utilizadas em habitantes de regiões expostas à radiação ionizante, para impedir a entrada do iodo radioativo (Nauman et al., 1993). Existem evidências de um efeito protetor do iodo a longo prazo, pois estudos epidemiológicos em regiões expostas a radiação indicam que crianças habitantes de regiões com dieta suficiente ou de excesso de iodo, apresentam menor incidência de PTC em relação a habitantes de regiões deficientes em iodo (Cardis et al., 2005). Desta forma, o papel do excesso de iodo parece se estender além do efeito bloqueador da entrada de iodo radioativo, extravasando para uma regulação das vias clássicas MAPK e TGF , de grande importância na regulação da função tiroidiana.

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6 CONCLUSÃO

No modelo de indução do oncogene RET/PTC3 em células foliculares tiroidiana, o tratamento com alta concentração de iodo:

inibe a proliferação,

reduz a expressão de efetores da via MAPK,

recupera a expressão de genes estimulatórios à via inibitória de TGF

restaura a expressão de genes específicos tiroidianos.

O iodo em alta dose induz a quiescência transiente e a refratariedade aos efeitos moleculares da ativação do oncogene RET/PTC3 em células foliculares tiroidianas.

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