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Nos baços dos animais dos grupos Controle, Lapachol e Timol, chamou atenção a intensa hipoplasia da polpa branca, sendo menos frequente nos animais tratados com os antimoniais (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a associação Lapachol+Pentostam® (FIG. 14A).

Em todos os grupos, foi observada discreta histiocitose sem formação de granulomas. Apenas dois animais do grupo controle apresentaram raros granulomas, distribuídos na polpa vermelha de forma não organizada. Os macrófagos apresentavam-se intensamente vacuolados, entretanto, amastigotas não foram visualizadas em nenhum grupo, apesar de diligente procura (FIG. 14B).

Ainda foram encontradas outras alterações tais como, congestão sinusoidal e mielopoiese aumentada. A mielopoiese foi mais frequente nos animais do grupo Controle, Lapachol e Timol, sendo menos observada nos animais tratados com Pentostam® ou com a associação Lapachol+ Pentostam®.

FIGURA 8 – Linfonodo de controle não tratado. (A) Intensa

histiocitose sinusal e parenquimal, sem formação de granulomas.

S, sinusal; P, parenquimal. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 8. HE, 100x. FIGURA 9 – Linfonodo de controle não tratado.

Setas indicando macrófagos vacuolados, volumosos e parasitados. HE, 400x.

8A

8B

9

P

S

FIGURA 10 – Linfonodo de controle não tratado. (A)

Intensa hiperplasia folicular. HE, 40x. (B) Destaque para os folículos linfáticos. CG, centro germinativo; SM, seio medular. HE, 100x. FIGURA 11 – Linfonodo de controle

não tratado mostrando intensa plasmocitose. HE, 400x.

CG

CG

SM

10A

10B

11

FIGURA 12 – Linfonodo de hamster tratado com lapachol. (A) Extensas áreas de necrose e apoptose com acentuada

hipoplasia folicular. NC, necrose; AP, apoptose. HE, 40x. (B) Detalhe da Fig. 12A. HE, 400x. (C) Setas indicando amastigotas parasitando macrófagos. HE, 1000x.

AP

NC

12A

12B

FIGURA 13 – Linfonodo de hamster tratado com antimonial. Histiocitose, hiperplasia folicular e plasmocitose

discretas. HE, 40x. FIGURA 14 – Baço de controle não

tratado. (A) Marcante hipoplasia da polpa branca. FL, folículo

linfático. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 14A, com setas indicando os macrófagos vacuolados e volumosos. HE, 100x.

FL

13

14A

4. DISCUSSÃO

os últimos anos vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas antiparasitárias a partir de extrações de plantas (Phillipson et al., 1993, 1995; Iwu et al., 1994; Kirby, 1996). O timol e o lapachol são constituintes químicos isolados originalmente de plantas consideradas medicinais (Sousa et al., 1991). O uso do timol para o tratamento de algumas helmintíases (Gupta et al., 1967; Gaitonde et al., 1968; Sanghavi & Mistry, 1971) e suas propriedades bactericida, antimicótica e antisséptica já estão bem estabelecidas (Shapiro et al., 1994; Mahmoud, 1994; Viollon & Chaumont, 1994). O lapachol foi testado no passado como agente antimalárico (Wendel, 1946; Fieser & Richardson, 1948) e são reconhecidas suas atividades antimicrobiana (Lima et al., 1956) e anti-parasitária (Pinto et al., 1977; Lopes et al., 1978; Shapiro et al., 1982). O conhecimento das propriedades biológicas dessas duas drogas instigou-nos a investigar a possibilidade da existência de atividade leishmanicida, o que ensejaria uma alternativa para o tratamento da leishmaniose.

Na literatura observa-se que muitos constituintes químicos extraídos de plantas que apresentaram efeito leishmanicida, já eram conhecidos previamente por seus efeitos anti- parasitários e, ou antimicrobianos. No entanto, boa parte destas substâncias foi testada somente para a forma promastigota de Leishmania, in vitro, faltando ensaios in vivo para confirmação dessa atividade leishmanicida (Iwu et al., 1994).

A triagem de drogas com base na atividade leishmanicida para a forma promastigota serve como um indicativo de ação da droga, e muitos pesquisadores utilizam-na, mas não tem sido suficiente para determinar se essas substâncias serão ativas também contra as formas intracelulares amastigotas. As formas amastigotas residem nos fagolisossomos de macrófagos, o que significa que a droga deve ser capaz de atravessar as membranas da célula hospedeira e atingir o interior do vacúolo fagolisossomal. Além disso, existem evidências de diferenças metabólicas entre promastigotas e amastigotas. Por exemplo, amastigotas consomem mais ácidos graxos do meio de cultura do que promastigotas em fase logarítmica de crescimento (Berman, 1988). Diferenças como essa podem explicar o fato de determinadas substâncias serem ativas contra uma forma e não contra a outra, como é o caso dos antimoniais, que atuam sobre amastigotas, mas são muito pouco eficazes

N

contra promastigotas (Moreira et al., 1995; Callahan et al., 1997). Optamos por avaliar as substâncias em estudo contra amastigotas intracelulares in vitro e, subsequentemente, testá- las no modelo in vivo para confirmação do efeito leishmanicida.

Parasita intracelular estrito como a Leishmania compartilha muitas vias bioquímicas com sua célula hospedeira, portanto, para testar se as drogas eram seletivas para lisar apenas as amastigotas, sem causar danos à célula hospedeira, foi investigada a citotoxicidade para macrófagos. Os resultados mostraram que o timol foi a mais tóxica das drogas testadas. Esta marcante toxicidade do timol para macrófagos, em doses ≥ 0,062mg/ml, possivelmente pode ser explicada pelo fato dessa droga ser um composto fenólico. Sabe-se que alguns fenóis são substâncias bastante ativas quimicamente, podendo ser muito irritantes (Alterthum, 1982). Entre os antimoniais, o estibogluconato de sódio (Pentostam®) mostrou-se o mais tóxico. Saldanha (1997) encontrou que o estibogluconato de sódio BP88®, fabricado na China e importado pelo Ministério da Saúde a partir de 1996, o mesmo utilizado neste trabalho, é mais tóxico que o antimoniato de meglumina (Glucantime®), o que vem corroborar nossos achados.

As substâncias em estudo foram em seguida avaliadas contra amastigotas intracelulares e, com exceção do timol, todas apresentaram efeito leishmanicida em concentrações não tóxicas para macrófagos. Para o timol, este efeito só foi encontrado nas concentrações acima de 0,25mg/ml, que também foram tóxicas para macrófagos. Portanto, o percentual da atividade leishmanicida observado com o timol, nestas concentrações, pode não representar necessariamente uma ação direta sobre o parasita, mas sim o somatório de sua ação tóxica para macrófago e seu efeito leishmanicida. Esses resultados leishmanicidas

in vitro, do timol e lapachol, estão de acordo com os dados encontrados na literatura.

Classes de substâncias como os terpenos e as naftoquinonas, das quais fazem parte o timol e o lapachol, respectivamente, são citadas na revisão de Iwu et al. (1994) como tendo apresentado atividade sobre algumas espécies de Leishmania, indicando que pudessem ser importantes classes de novos agentes terapêuticos para a leishmaniose.

Nos ensaios in vivo, demonstramos que, apesar do timol e do lapachol terem

apresentado importante efeito anti-amastigota in vitro, estas substâncias não foram capazes de conter o desenvolvimento de lesões em hamsters infectados por L. (V.) braziliensis. Tais

resultados suscitam a hipótese de que, in vivo, possivelmente as drogas sejam convertidas em metabólitos inativos ou sejam neutralizadas, perdendo sua ação leishmanicida.

A relação estrutura-atividade do lapachol e de vários de seus análogos foi revisada por Discroll et al., em 1974. Estes autores demonstraram que a remoção do grupo hidroxila ou do isopentanila reduzia para 50% a atividade antitumor, enquanto que a remoção do anel aromático originava um produto inativo. Redução, oxidação ou isomerização de uma das cadeias também suprimia a atividade, assim como a adição de água para a ligação dupla de carbonos ou a troca da hidroxila por um grupamento amino ou metilamino (Sieber et al.,1976). Não podemos descartar a possibilidade do lapachol, uma vez absorvido, ter sido transformado em um metabólito inativo, podendo ser esta uma das prováveis explicações para sua fraca atuação in vivo. Outro ponto que merece destaque é a concentração plasmática do lapachol. Block et al. (1974) relataram que, apesar da concentração plasmática ideal para a eficácia da atividade antitumor ter sido determinada como sendo de 30-35µg/ml, esta concentração nunca pôde ser alcançada em pacientes cancerosos que receberam o lapachol, sem que não apresentassem efeitos colaterais graves como anemia e diminuição do tempo de protombina. É possível que isso também tenha acontecido no nosso ensaio e o lapachol não apresente efeito leishmanicida in vivo pela impossibilidade de atingir um ótimo nível plasmático na concentração utilizada (300mg/kg/dia).

Drogas administradas por via oral, bem absorvidas no trato gastrointestinal, assim como drogas aplicadas por via intravenosa, atingem o sítio alvo apropriado através da corrente sanguínea, sendo carreadas pelo sangue em um estado livre ou ligadas à proteínas plasmáticas. Uma vez que uma droga se liga a uma proteína ela pode ser farmacologicamente inativada e isto parece acontecer com β-lapachona e outras naftoquinonas derivadas do lapachol, cujos efeitos tripanosomatida in vivo não correspondem aos encontrados in vitro, quando na presença de sangue ou soro. Estas naftoquinonas derivadas, na presença de oxihemoglobina, induzem a formação de metahemoglobina com suas concomitantes transformações em substâncias inativas (Lopes et al., 1978), o que sugere que o lapachol, uma naftoquinona, provavelmente também possa ser inativado pela redução ou interação com proteínas do soro.

As substâncias ativas contra amastigotas de Leishmania podem atuar direta e seletivamente contra o parasita ou indiretamente, através da ativação de mecanismos microbicidas do macrófago, como o aumento da produção de radicais livres do oxigênio e óxido nítrico (NO), provavelmente o mecanismo mais importante de destruição de

Leishmania empregado por essas células (Liew et al., 1990; Stenger et al., 1994). Recentes

estudos, in vitro, utilizando neurônios de ratos, apontam para o fato de que lapachol e outras quinonas são inibidores da produção de NO, podendo possivelmente afetar, in vivo, as ações fisiológicas e, ou fisiopatológicas dependentes deste mecanismo oxidativo (Kumagai et al., 1998). No modelo in vitro, usou-se macrófago infectado por L. (V.)

braziliensis e nele, o lapachol mostrou-se muito ativo; portanto, seria interessante avaliar a

produção de NO neste sistema. É possível que o lapachol possa inibir seletivamente determinadas funções dos macrófagos, ou seja, como os sinais que estimulam os mecanismos oxidativos são independentes, não se pode descartar a possibilidade de que o lapachol possa, ao mesmo tempo, inibir a NO sintetase e aumentar a produção de peróxido de hidrogênio e outros intermediários reativos do oxigênio. Outra hipótese seria a de que a droga poderia estar agindo indiretamente sobre o parasita e não necessariamente através da ativação do macrófago.

Alguns terpenóides extraídos de plantas, como o ácido tormêntico, inibem o crescimento de promastigotas, mas não têm efeito sobre amastigotas intracelulares (Santos, 1997) e apresentam o mesmo esqueleto básico do ácido ursólico, outro terpenóide descrito como um potente inibidor do crescimento de promastigotas e amastigotas de L.

amazonensis (Sauvain et al., 1993). Entretanto, o ácido tormêntico possui duas hidroxilas a

mais e este nível de oxidação mais alto provoca uma maior polaridade, consequentemente, tem menor capacidade de transpor membranas biológicas, o que pode explicar sua inatividade contra amastigotas intracelulares. No entanto, essa parece não ser a explicação para a fraca atividade leishmanicida do timol in vivo, que assim como as substâncias citadas acima, é também um terpenóide, uma vez que sua estrutura química é relativamente mais simples e apresenta apenas uma hidroxila. Não temos conhecimento de nenhum estudo mostrando que o timol possa ter dificuldades de atravessar membranas biológicas, ao contrário, sendo uma substância lipofílica, seus efeitos antimicrobianos são usualmente atribuídos ao seu tropismo por membranas (Shapiro & Guggenheim, 1995). Portanto, uma vez que o timol não apresentou efeito terapêutico no modelo in vivo utilizado neste trabalho, podemos considerar a possibilidade da inativação e, ou neutralização desta droga

in vivo. Podemos ainda conjecturar que provavelmente a dose que usamos (14mg/kg/dia)

tenha sido insuficiente para causar alguma atividade leishmanicida in vivo, entretanto, doses maiores seriam tóxicas para os animais.

Nos experimentos realizados,o efeito curativo dos antimoniais já pôde ser observado a partir da segunda semana de tratamento, quando os animais que receberam estas drogas apresentaram uma redução significativa das lesões em relação aos animais do controle não tratados. No entanto, apesar destas drogas terem sido capazes de conter o desenvolvimento das lesões no hamster infectado e da aparente cura clínica, ainda foi possível encontrar parasitas viáveis nos linfonodos após 42 dias de tratamento (104/linfonodo). Bjorvatn & Neva (1979), trabalhando com camundongos BALB/c infectados com L. tropica e tratados com Pentostam® (400mg/kg/dia), relataram que parasitas viáveis ainda foram visualizados no fígado dos animais ao final de 41 e 83 dias de infecção. Inchausti et al. (1997), quantificando a carga parasitária das patas lesionadas de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis e tratados com Glucantime® (28mg/kg/15dias), encontraram 105 parasitas/pata. Diante de tais achados, tem sido postulado que os antimoniais não são capazes de erradicar completamente os parasitas dos tecidos de animais infectados por

Leishmania, mesmo diante de uma aparente cura clínica, o que explicaria o ressurgimento

das lesões em pacientes imunosuprimidos e que já foram tratados anteriormente para leishmaniose. Os resultados encontrados são, portanto, compatíveis com estes descritos na literatura.

Os animais que receberam a associação lapachol+Pentostam® apresentaram o mesmo comportamento que os tratados apenas com o Pentostam®, indicando que a ação terapêutica observada deve ser creditada ao efeito do antimonial. Apesar do lapachol não ter apresentado efeito terapêutico na leishmaniose experimental, vale salientar que as úlceras desenvolvidas nos animais tratados com esta droga mostraram-se menos úmidas e aparentemente sem contaminação bacteriana, o que pode ser explicado pelos comprovados efeitos antiinflamatório e antimicrobiano desta substância (Lima et al., 1956; De Almeida et al., 1990).

Alguns achados nos animais tratados com lapachol merecem comentários, como por exemplo, a cor castanha-avermelhada da urina e a neurotoxicidade. Morrison et al. (1970)

descreveram, em seus estudos de toxicidade do lapachol, o aparecimento de urina castanha-avermelhada nos animais submetidos ao tratamento com variadas doses da droga, explicando este sinal pela combinação do lapachol livre com a bilirrubina. Sabe-se que soluções de lapachol são amarelas em pH abaixo de 6 e vermelhas acima deste patamar. Para excluir a possível ocorrência iatrogênica de fenômenos hemorrágicos do sistema urinário, como cistite hemorrágica ou necrose, os rins e bexigas dos animais foram examinados e nenhuma alteração foi observada. Entretanto, em relação aos achados de neurotoxicidade, não encontramos referências na literatura consultada, sendo este o primeiro trabalho, em nosso conhecimento, que descreve este efeito colateral em hamsters tratados com esta substância.

Na tentativa de avaliar melhor a neurotoxicidade do lapachol, animais sadios e animais infectados por L. (V.) braziliensis foram submetidos ao tratamento com a mesma dose de lapachol (300mg/kg/dia) e pelo mesmo período de tempo (42 dias) que os animais do ensaio e somente os animais infectados apresentaram sinais neurotóxicos (dados não apresentados). Esse fato sugere que, possivelmente, substâncias liberadas no processo inflamatório induzido por L. (V.) braziliensis possam potencializar um efeito tóxico da droga na concentração utilizada no experimento. Entretanto, este é um ponto que merece ser esclarecido através de estudos futuros.

Os percentuais de mortalidade de 37,5% e 25% encontrados nos grupos tratados com o lapachol e com a associação lapachol+Pentostam®, respectivamente, não podem ser atribuídos exclusivamente à droga, uma vez que ocorreram mortes também no grupo controle infectado (25%). Infelizmente, foi impossível fazer a histologia do pulmão dos dois animais do grupo controle mortos, uma vez que já estavam em estado avançado de decomposição. Entretanto, no estudo histopatológico dos demais animais que morreram ao longo do tratamento, foi detectado pneumonite. Não foi possível determinar se esta pneumonite foi causada por aspiração durante a administração da droga ou por microrganismos oportunistas na vigência de uma imunosupressão induzida pela infecção leishmaniótica ou pelo lapachol, visto que é uma substância anti-mitótica. Nos estudos de Morrison et al. (1970), os principais indicativos de toxicidade pelo lapachol, quando administrado por via oral em altas doses, foram a anemia, nas primeiras duas semanas de administração da droga, e uma elevação no tempo de protrombina, que podia ser corrigida ou controlada com uma simples aplicação de Vitamina K. Dos animais testados no estudo

de Morrison et al. (1970), tais como camundongos BALB/c, ratos albinos Charles River CD e cães da raça beagle, todos apresentaram uma transitória leucocitose, e apenas em macacos foi detectado leucopenia. Para esclarecer nossos achados, submetemos um grupo de hamsters sadios ao tratamento com o lapachol na mesma dose utilizada em nossos ensaios e avaliamos o leucograma antes de iniciar o tratamento, com 15, 30 e 40 dias. Constatamos uma completa ausência de leucopenia (dados não apresentados), sugerindo que o lapachol, por si só, na dose utilizada nesse trabalho (300mg/kg/dia), não induz leucopenia em hamster, a despeito de sua ação anti-mitótica.

Um grande número de roedores e primatas são susceptíveis à infecção por

Leishmania sp. e, entre eles, estão os hamsters. Estudos comparativos de susceptibilidade à

infecção por cepas patogênicas do Novo Mundo, utilizando camundongos BALB/c, CBA/H, CDI e hamsters, puderam mostrar que este último é o hospedeiro mais susceptível para a L. braziliensis (Neal & Hale, 1983). A ocorrência de disseminação para o linfonodo regional, baço e fígado do hamster infectado com diferentes espécies de Leishmania dermotrópicas tem sido bem documentada na literatura (Lainson & Shaw, 1979; Wilson & Lollini, 1980; Cuba Cuba et al., 1985; Kahl et al., 1990, 1991; Almeida et al., 1996; Sinagra et al., 1997). Outros estudos têm correlacionado essa disseminação para baço e linfonodo com a gravidade da doença (Scott & Farrel, 1982).

Os achados histopatológicos do baço dos animais do presente estudo, corroboram aqueles de Kahl et al. (1991), os quais também encontraram alterações tais como hipoplasia da polpa branca, congestão sinusoidal e mielopoiese aumentada em hamsters infectados por L. (V.) braziliensis. Chamou-nos atenção o baixo parasitismo no baço, inclusive dos animais do grupo controle infectado. Em hamsters, pode ocorrer visceralização pelo parasita ainda nas primeiras 4 semanas de infecção (Travi et al., 1988; Sinagra et al., 1997), entretanto, a presença de amastigotas no baço de animais infectados por espécies dermotrópicas de Leishmania não tem sido descrita com frequência (Kahl et al., 1991). Tem sido relatada raramente (Wilson & Lollini, 1980; Almeida et al., 1996), ou parasitas são detectados em baixo número (Sinagra et al., 1997). A presença de L.

braziliensis é mais abundante no sítio cutâneo do que nas vísceras, refletindo o crescimento

diferencial de cepas viscerotrópicas e dermotrópicas em temperaturas acima de 340C (Almeida et al., 1996). Outra alteração encontrada e digna de comentário é o achado da marcante hipoplasia de polpa branca nos animais de todos os grupos, embora menos

frequente nos animais tratados com antimonial (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a associação lapachol+Pentostam®. Esta alteração indica provavelmente um quadro de imunosupressão e tem sido descrita em outros estudos com hamsters infectados por

Leishmania, tais como L. braziliensis, L. mexicana e L. donovani, sugerindo que a

hipoplasia esplênica possa ser a base da disseminação do parasita para as vísceras e outros sítios, bem como, a responsável pelo agravamento das lesões (Wilson & Lollini, 1980; Veress et al., 1983; Sehgal & Arora, 1985; O’Daly & Cabrera, 1986).

Os achados histopatológicos nos linfonodos satélites dos animais do grupo controle infectado, consistindo predominantemente de uma intensa histiocitose com magrófagos vacuolados e volumosos e contendo muitas amastigotas, não diferiram daqueles encontrados na literatura (Kahl et al., 1991; Almeida et al., 1996). Uma exceção foi a ausência de granulomas nos linfonodos de todos os grupos, com exceção de dois animais do grupo controle infectado. Tem sido postulado que na LT a formação de granuloma maduro ou imune, com a participação de linfócitos T CD4+, fenótipo TH1, e com ativação

de macrófagos por citocinas, provavelmente representam o fator chave na destruição parasitária, com controle da infecção (Ridley, 1979; Grimaldi, 1982; Magalhães et al., 1986). A ausência de granulomas nos animais do ensaio pode representar, portanto, um padrão de infecção não resolutivo.

O quadro histopatológico dos linfonodos nos animais tratados com o lapachol chamou atenção pela presença de extensas áreas de necrose e apoptose. Esta necrose tanto pode indicar um importante fator no controle da infecção por mecanismo adquirido de imunidade celular efetiva, como pode representar um elemento na patogênese da LT ou ambos. Rocha (1998), estudando linfonodos de pacientes com a forma bubônica de LT, pôde detectar níveis elevados de TNF-α (fator de necrose tumoral-α) bem como extensa necrose, principalmente quando o tempo de evolução excedia 7 semanas. Esta citocina funciona como um importante mediador pró-inflamatório, e em níveis elevados, promove extensa necrose tumoral e, eventualmente, de tecidos normais. Além disso, pode induzir apoptose e, ou necrose isquêmica por coagulação intravascular que afeta a microcirculação local (Abbas et al., 1991). A apoptose deve desempenhar papel significativo na contenção da replicação da Leishmania, bem como, na regulação da resposta inflamatória, uma vez que inibe a secreção de citocinas quimiotáticas, como a IL-8 (interleucina-8), diminuindo,

desta maneira, o recrutamento de células fagócitas (Savill, 1997). É possível que o quadro histopatológico encontrado nos linfonodos dos animais tratados com o lapachol, possa representar mais um fator na patogênese da doença, dado que, apesar da necrose e apoptose observados, não houve redução significante na carga parasitária.

Diferentemente dos achados histopatológicos dos baços, nos linfonodos dos animais do grupo controle infectado foram encontradas marcantes hiperplasia folicular e plasmocitose, com ausência de hiperplasia paracortical (área de linfócitos T), sugestivo de uma resposta imunológica tipo TH2. Tais resultados suscitam a hipótes de que,

possivelmente, em hamsters, estes dois compartimentos, baço e linfonodo, respondam de