İşçi Buluşları İle İlgili Hak Ve Yükümlülüklerin Sonraya Etkisi a) Genel olarak

A expressão das citocinas que indicam estímulo da resposta imune celular Th-1 (interferon-γ) ou Th-2 (IL-4 e IL-10) foram realizadas por PCR em tempo real, utilizando-se para tanto iniciadores sintéticos específicos para amplificação dos genes de β-actina (controle endógeno), INF-γ, IL-4 e IL-10. A PCR foi realizada no Laboratório de Infectologia Molecular Animal – BIOAGRO, utilizando o equipamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Após 3 imunizações, o baço dos animais imunizados foi extraído e processado. Uma alíquota de 5 x 106 células/poço foi semeada em placas de

24 poços e submetidas a estímulo com 0,5 e 0,1 MOI de vírus Dengue-2. Como controle negativo foi utilizado meio RPMI-1640 completo e para o controle positivo as células foram estimuladas com Concanavalina A (ConA) na concentração 0,2 µg/mL. As placas foram incubadas a 37°C por 2 horas, período após o qual as células foram coletadas e processadas para extração do RNA e confecção do cDNA.

5.1. CONSTRUÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES 5.1.1. Amplificação dos genes prM/DENV-2 e prM/DENV-3

Após extração de RNA dos vírus DENV-2 (New Guinea C) e DENV-3 (H87), foi realizada a confecção do cDNA dos respectivos vírus. Este cDNA foi utilizado como molde em uma reação em cadeia da polimerase, utilizando os “primers” específicos para os genes prM/DENV-2 e prM/DENV-3. A figura 1 demosntra a amplificação dos fragmentos prM/DENV-2 e prM/DENV-3.

Figura 1. Amplificação dos genes prM/DENV-2 e prM/DENV-3. Eletroforese dos

produtos de amplificação dos cDNAs DENV-2 e DENV-3 em gel de agarose 0,8%. Da esquerda para a direita: canaleta1: marcador 100pb (100 pb DNA Ladder, Invitrogen, Califórnia, EUA), canaleta 2: banda de 540 pb referente à amplificação do gene prM/DENV-2, canaleta 3: banda de 540 pb referente à amplificação do gene prM/DENV-3.

5.1.2. Clonagem dos genes prM/DENV-2 e prM/DENV-3 no plasmídeo de clonagem pGEM-T

Os fragmentos obtidos por PCR foram purificados conforme especificado na metodologia, e utilizados para ligação em plasmídeo de clonagem pGEM-T. A reação de ligação foi realizada a 4°C, e os produtos desta reação inseridos em bactérias E. coli DH5α ultracompetentes. As colônias transformadas foram selecionadas em meio contendo ampicilina e submetidas à extração de DNA plasmidial pelo método de lise alcalina. Conforme pode ser observado nas figuras 2 e 3, tanto os fragmentos de

prM/DENV-2 quanto os de prM/DENV-3 foram eficientemente clonados no plasmídeo pGEM-T. Foram selecionados para dar continuidade ao trabalho, os clones de número 51 (prM/DENV-2) e 13 (prM/DENV-3).

Figura 2. Clonagem de prM/DENV-2 em vetor pGEM-T. Eletroforese em gel de

agarose 1,5% dos produtos de amplificação dos plasmídeos pGEM-T/prMDENV-2 extraídos das colônias selecionadas por resistência ao antibiótico ampicilina. Da esquerda para a direita: canaleta 1: marcador 100 pb, canaleta 2: cDNA DENV-2 (controle positivo), canaleta 3: controle negativo. Nas canaletas 4, 6, 7, 8, 9, 11 a 15 as bandas com tamanho aproximado de 540 pb são correspondentes ao fragmento prM/DENV-2 amplificado.

Figura 3. Clonagem de prM/DENV-3 em vetor pGEM-T. Eletroforese em gel de

agarose 1,5% dos produtos de amplificação dos plasmídeos pGEM-T/prMDENV-3 extraídos das colônias selecionadas por resistência ao antibiótico ampicilina. Da esquerda para a direita: canaleta 1: marcador 100 pb, canaleta 2: cDNA DEN-3 (controle positivo), canaleta 3: controle negativo. Nas canaletas 4, 6 a 9 e 13 a 15, as bandas com tamanho aproximado de 540 pb são correspondentes ao fragmento prM/DENV-3 amplificado.

5.1.3. Análise por sequenciamento dos fragmentos clonados 3 2 9 4 8 5 6 7 1 10 11 12 13 14 15 500 pb 540 pb 3 2 9 4 8 5 6 7 1 10 11 12 13 14 15 16 500 pb 540 pb

Os plasmídeos recombinantes obtidos após ligação dos amplicons no vetor pGEM-T foram enviados ao laboratório de Genômica - BIOAGRO/UFV, onde foi realizado o sequenciamento de ambos os clones, utilizando o seqüenciador automático MegaBACETM 500 (GE Healthcare, Inglaterra). As seqüências obtidas foram analisadas através do alinhamento com as seqüências presentes no banco de dados NCBI.

Para análise da identidade dos fragmentos, a seqüência obtida foi alinhada através da ferramenta Basic Local Alignment Tool (BLAST). No BLASTn, para o clone 51 (pGEM-T-prM/DENV-2), foi obtida uma identidade de 98% do fragmento clonado com o gene codificante da proteína prM do vírus Dengue-2, com apenas 1% de gaps na seqüência. Já para o clone 13, referente ao gene da prM/DENV-3, o alinhamento demonstrou identidade de 96% com a seqüência do gene responsável por codificar a proteína prM do vírus Dengue-3, com 2% de gaps.

No BLASTx, em relação ao clone 51, sua seqüência traduzida obteve uma identidade de 97%, e uma similaridade de 98% com a proteína prM do vírus Dengue-2, não apresentando nenhum gap. Para o clone 13, a tradução de sua seqüência revelou que existia 76% de identidade, 86% de similaridade e apenas 1 gap em relação a seqüência aminoacídica da proteína prM do vírus Dengue-3.

Para acessar a proximidade entre as seqüências das proteínas prM de ambos os vírus, as mesmas foram alinhadas utilizando a ferramenta BLAST two sequences. Nos isolados selvagens, a identidade entre as seqüências codantes das proteínas prM dos vírus DENV-2 e DENV-3 é de

71%, apresentando 2% de gaps. Entretanto, apresentam 70% de seus resíduos de aminoácidos idênticos, e 84% de similaridade sem gaps.

A Última fase da análise das seqüências teve como objetivo verificar se os clones obtidos apresentavam os mesmos padrões em termos de similaridade e identidade observados nos genes selvagens. Em relação à seqüência nucleotídica, nossos clones acompanham o padrão de identidade dos isolados de ocorrência natural, 70% de identidade nucleotídica, com 3% de gaps. Entretanto, em termos de seqüências aminoacídicas, esta tendência se desloca para uma maior proximidade entre os genes clonados. Após a tradução e comparação das seqüências traduzidas de ambos os fragmentos, verificou-se uma identidade de 75% de seus resíduos aminoacídicos com 91% de similaridade e nenhum gap.

Tabela 1. Avaliação da similaridade de seqüências aminoacídicas das proteínas

prM. (*Dados mostrados em valores percentuais).

Identidade* Similaridade* “Gaps”*

pGEM-T/prMD2 vs prMDEN-2 97 98 0

pGEM-T/prMD3 vs prMDEN-3 76 83 1

prMDEN-2 vs prMDEN-3 70 84 0

Figura 4. Comparação da seqüência aminoacídica das proteínas prM/DENV-2 e

prM/DENV-3. Alinhamento entre as duas seqüências de aminoácidos correspondentes às seqüências nucleotídicas prM/DENV-2 e prM/DENV-3 para a detecção do grau de identidade entre ambas, realizada pelo programa “Clustal W”. Ferramentas no site: www.ebi.ac.uk/clustalw.

5.1.4. Clonagem dos genes prM/DENV-2 e prM/DENV-3 no plasmídeo de expressão pCID2Et

O próximo passo para possibilitar a inserção dos fragmentos de interesse no vetor vacinal pCID2Et, foi a clivagem enzimática do plasmídeo pCID2Et, assim como do fragmento contido no vetor de clonagem com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI, cujos sítios de clivagem foram inseridos durante amplificação.

Figura 5. Mapa de restrição dos plasmídeos pGEM-T recombinantes. Eletroforese

em gel de agarose 1,5% dos fragmentos digeridos com as enzimas EcoRI e XhoI. Da esquerda para a direita: canaleta 1: marcador λ HindIII, canaletas 2, 3 e 4: bandas de aproximadamente 540 pb, referentes ao fragmento prM/DENV-2 e

600 p b 540 p b

canaletas 5, 6 e 7: bandas de aproximadamente 540 pb, referentes ao fragmento prM/DENV-3.

Após digestão dupla, os produtos de clivagem foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% (figura 5) e o plasmídeo pCID2Et em gel de agarose 0,8% (figura 6).

Figura 6. Mapa de restrição do plasmídeo pCID2Et. Eletroforese em gel de agarose

0,8% dos plasmídeos pCID2Et digeridos com as enzimas EcoRI e XhoI. Da esquerda para a direita: canaleta 1: marcador λ HindIII, canaletas 2 a 7: bandas de aproximadamente 5300 pb, referente ao plasmídeo pCDI2Et digerido.

Dando prosseguimento aos experimentos para clonagem dos fragmentos de prM/DENV-2 e prM/DENV-3 no pCID2Et, as bandas de 540 e as de 5300 pb foram excisadas do gel e utilizadas para purificação dos fragmentos . Finalizada a purificação dos produtos de digestão, estes foram utilizados em uma reação de ligação a fim de inserir o gene de prM no plasmídeo de expressão já modificado para expressão de E. Os clones recombinantes foram isolados em uma placa réplica e processados para extração do DNA plasmidial. Os plasmídeos obtidos foram utilizados em reações de PCR para verificar a presença do inserto de interesse. Observando as figuras 7 e 8 é possível notar que tanto o fragmento

1 2 3 4 5 6 7 6557 p b

prM/DENV-2, quanto o prM/DENV-3 foram inseridos de modo eficiente no vetor vacinal.

Figura 7. Inserção de prM/DENV-2 no plasmídeo pCID2Et. Eletroforese em gel de

agarose 1,5% dos produtos PCR dos plasmídeos pCID2Et/prM/DENV-2 recombinantes. Da esquerda para a direita: canaleta 1: marcador 100 pb, canaleta 2: controle negativo, canaleta 3: controle positivo, canaletas 4 e 5, 7 a 19: bandas de aproximadamente 540 pb, referentes ao inserto prM/DENV-2.

Figura 8. Inserção de prM/DENV-3 no plasmídeo pCID2Et. Eletroforese em gel de

agarose 1,5% dos produtos PCR dos plasmídeos pCID2Et/prM/DENV-3 recombinantes. Da esquerda para a direita: : canaleta 1: marcador 100 pb, canaleta 2: controle negativo, canaleta 3: controle positivo, canaletas 9, 12 e 13: bandas de aproximadamente 540 pb, referentes ao inserto prM/DENV-3.

Os plasmídeos vacinais aprimorados expressando as proteínas prM/DENV-2 e prM/DENV-3 foram denominados pCID2EtD2prM e pCID2EtD3prM, respectivamente.

O clone 42 (pCID2EtD2prM) e o 26 (pCID2EtD3prM) foram escolhidos para desenvolvimento de análises quanto à expressão de E à imunogenicidade destas duas construções vacinais.

500 3 2 4 5 6 7 8 9 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 540 3 2 9 4 8 5 6 7 1 10 11 12 13 500 540 p b

As análises bioquímicas demonstraram que a expressão da proteína E foi maior nas células transfectadas com o plasmídeo pCID2EtD3prM. Na imunoprecipitação seguida de separação eletroforética das proteínas as bandas protéicas obtidas foram submetidas à densitometria ótica que apresentou a indicação de que a proteína prM/DENV-3 aumentou a expressão da proteína E truncada em 67,02% com relação à proteína prM/DENV-2 (figura 9).

Figura 9. Detecção da expressão da proteína E por células transfectadas com os

plasmídeos recombinantes. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% mostrando, da esquerda para a direita, marcador de peso molecular de proteínas (“Molecular Weight Marker”, Sigma-Aldrich, Alemanha), controle negativo de imunoprecipitado de extrato celular de células transfectadas com o vetor pCI “vazio”, imunoprecipitado de células transfectadas com pCID2EtD2prM e imunoprecipitado de células transfectadas com pCID2EtD3prM.

A seguir são demonstrados os resultados dos testes realizados para avaliar se este aumento da expressão de E pelo plasmídeo pCID2EtD3prM acarreta alguma alteração na resposta imune induzida pelo mesmo.

5.2. AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE DOS PLASMÍDEOS RECOMBINANTES

5.2.1. ELISA

A fim de verificar se os animais inoculados haviam produzido anticorpos específicos para a proteína E, o soro dos mesmos foi coletado antes da primeira imunização (controle negativo), e quinze dias após cada inoculação e avaliados por ELISA indireto. Os dados indicam que os animais vacinados com plasmídeo pCID2EtD3prM apresentaram maior soroconversão tanto em relação ao plasmídeo controle pCID2Et quanto à construção pCID2EtD2prM (figura 10) .

pCID2EtD3prM pCID2EtD2prM pCID2Et pCI 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 15 30 45 a b so rb ân ci a 492 n m

Figura 10. ELISA indireto para detecção de anticorpos específicos para a proteína

E do vírus Dengue-2. As barras indicam a quantidade dos anticorpos com 15, 30 e 45 dias após a primeira vacinação, respectivamente.

Os dados foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Bonferroni a 0,05 de significância. Os resultados demonstraram que a diferença foi estatisticamente significante entre o grupo pCID2EtD3prM e pCID2EtD2prM.

5.2.2. Linfoproliferação

Para avaliar a resposta das células linfóides de camundongos imunizados com os plasmídeos recombinantes frente ao estímulo com Dengue-2, foi realizado um ensaio de linfoproliferação. As células de todos os grupos apresentaram proliferação, entretanto os resultados demonstraram maior ativação das células linfóides provenientes do baço dos animais vacinados com pCID2EtD3prM. Esta diferença se torna mais evidente quando é utilizado um MOI 0,1. pCID2Et e pCID2EtD2prM apresentaram valores similares de linfoproliferação (figura 11). Análises estatísticas utilizando o teste de Bonferroni demonstraram que a diferença foi significante para todos os grupos estimulados com 0,1 MOI de vírus. Entretanto, em relação ao MOI 0,5, a diferença estatisticamente significante foi encontrada apenas entre os plasmídeos contendo o inserto de prM em relação a construção original, não havendo diferença estatística entre pCID2EtD2prM e pCID2EtD3prM.

pCID2Et pCID2EtD2prM pCID2EtD3prM 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 MOI 0,5 ConA MOI 0,1 a b so rb ân cia a 560 n m

Figura 11. Ensaio de Linfoproliferação. Proliferação das células linfóides extraídas dos animais imunizados com os plasmídeos pCID2Et, pCID2EtD2prM e

pCID2EtD3prM após estímulo com DEN-2 (MOI 0,5 e 0,1) e ConA (controle positivo).

5.2.3. Caracterização fenotípica das células imunes

Os resultados apresentados nas figuras 12 e 13 e na tabela 2 apontam para uma maior indução de células de memória de ambos os tipos (CD4+ e CD8+) nos animais imunizados com o plasmídeo pCID2EtD3prM, quando em comparação com os grupos vacinados com pCID2Et e pCID2EtD2prM. Este padrão se manteve no que tange ao número de linfócitos TCD8+, e em relação à quantidade total de linfócitos T (CD4 + CD8). Entretanto, quando se comparou a quantidade de linfócitos TCD4+ induzida pela imunização com os plasmídeos construídos, observou-se que animais imunizados com pCID2EtD3prM e pCID2EtD2prM apresentaram quantidades similares deste tipo celular. Avaliação estatística dos dados realizada por teste T a 0,05 de significância indicou diferença estatisticamente significante entre pCID2EtD3prM e os demais grupos analisados, tanto em relação à quantidade de células TCD4, quanto TCD8.

Figura 12. Análise do fenótipo das células extraídas do baço dos animais imunizados. A) grupo imunizado com pCID2Et, marcação de células CD4+ de

Anti-CD4-FITC anti-CD8-FITC Anti-CD8-FITC Anti-CD8-FITC Anti-CD4-FITC Anti- CD44- PE- Cy5.5 Anti-CD4-FITC C 2) A nti C D44 PE- C y 5 .5

memóriaem A1 e de células TCD8+ de memória em A2;B) grupo imunizado com pCID2EtD2prM, marcação de células CD4+CD44+ em B1 e de células CD8+CD44+ em B2; C) imunização com o plasmídeo pCID2EtD3prM, marcação de Linfócitos TCD4+ de memória em C1 e linfócitos TCD8+ de memória em C2. Os valores citados correspondem à média de dois experimentos.

pCID2Et pCID2EtD2prM pCID2EtD3prM 0 5 10 15 20 25 % Lin fóc itos T C D 4 + de m e m ó ri a

pCID2Et pCID2EtD2prM pCID2EtD3prM

0 5 10 15 % de Li nf óc it os TC D 8 + de m e m ó ri a

Figura 13. Análise da indução de células de memória nos animais imunizados. A) Porcentagem de linfócitos TCD4+ de memória;B) Porcentagem de linfócitos TCD8+ de memória.

Tabela 2. Porcentagem de linfócitos induzida nos animais imunizados com as construções plasmidiais. CD4+ CD4+CD44+ CD8+ CD8+CD44+ CD4+/CD8+ Total de LT pCID2Et 31,2+ 3,01 12,2 + 2,09 10,9 + 1,09 5,0 + 0,52 3,09 42,17 pCID2EtD2prM 33,2 + 6,15 15,1 + 2,82 12,6 + 0,43 6,6 + 0,47 2,75 45,9 pCID2EtD3prM 34,8+ 18,0 18,0+ 7,83 18,8+ 4,41 11,8+ 2,25 1,85 53,55 5.2.4. Detecção de citocinas

As células extraídas do baço dos animais foram cultivadas durante 2 horas sob estímulo específico DENV-2 a fim de mensurar a expressão de RNA mensageiro de IL-4 e IL-10 (perfil TH2 de resposta) e INF-γ (perfil de resposta TH1).

Os dados obtidos demonstram um perfil predominantemente TH1, com grande expressão de INF-γ. A síntese de IL-10 também foi detectada, não superando, entretanto a expressão de INF-γ (tabela 3).

Tabela 3. Expressão de IL-4, IL-10 e INF-γ em comparação com o grupo controle, após estímulo com vírus Dengue-2.

Grupo IL-4 IL-10 INF-γ

pCID2Et 0,01 + 0,01 0,04 + 0,01 5,56 + 4,8 pCID2EtprMD2 0,015 + 0,01 0,09 + 0,03 6,62 + 3,45 pCID2EtprMD3 0,125 + 0,12 0,14 + 0,04 53,0 + 20,5

VIII. DISCUSSÃO

Tendo em vista a atual situação epidemiológica da dengue no Brasil e no mundo, é de consenso da comunidade científica em geral que existe uma necessidade crescente de uma vacina eficaz e de fácil acesso para prevenção da doença. Várias estratégias têm sido adotadas com esta finalidade, desde os métodos de atenuação viral clássicos ou através da engenharia genética, até as vacinas de DNA, dentro das quais se encaixa o presente estudo.

Especificamente, o objetivo deste estudo foi observar se a presença da proteína prM em um plasmídeo vacinal expressando a proteína E representaria aumento na capacidade do mesmo em gerar resposta imune em camundongos inoculados, tendo como suporte a observação em nosso laboratório de que esta construção apresentou aumento na expressão de E “in vitro”. Estudos demonstram que a proteína E co-expressando a proteína prM leva a indução da secreção de anticorpos neutralizantes e proteção de camundongos (Heinz et al., 1995). Outros trabalhos sugerem que há uma correlação entre os níveis de expressão da proteína E e a indução de anticorpos neutralizantes (Konishi, Fujii, and Mason, 2001; Konishi, Terazawa, and Fujii, 2003; Konishi et al., 1998; Konishi et al., 2000).

Estudos com outros flavivirus e com o próprio Dengue vírus evidenciam que para a correta manutenção da conformação de E é necessário a expressão concomitante da proteína prM (Guirakhoo and Roehrig, 1992; Konishi and Mason, 1993). Foi observado que no vírus da encefalite de Murray Valley, os vírions que continham a proteína prM não processada eram mais ácido-resistentes, sugerindo que a prM tem uma função de “chaperona” e protetora da proteína E de mudanças conformacionais irreversíveis no compartimento ácido da via secretória celular (Guirakhoo et al., 2006; Guirakhoo and Roehrig, 1992). Além do mais, evidências experimentais sugerem que os epítopos neutralizantes da proteína E contra os vírus Dengue sejam conformacionais (Henchal et al., 1985).

Ocazionez e Fonseca também demonstraram que a baixa proteção de uma vacina de DNA contra o DENV-2 pode ser resultante de uma fraca ativação do sistema imune como conseqüência de uma imperfeita secreção da proteína E truncada devido a ausência de prM (Ocazionez and Fonseca 2000).

Além do mais, nota-se que grande parte das pesquisas envolvendo construções plasmidiais expressando a proteína prM/E do vírus Dengue-3 apresentam melhores resultados em relação àquelas onde os plasmídeos continham o cassete de expressão da prM/E Dengue-2 (Blair et al., 2006; De Paula et al., 2008; Konishi et al., 2000). Estas observações levam a crer que a proteína prM/DENV-3 possa apresentar maior capacidade de chaperona, já que é sabido que prM tem papel fundamental na síntese, processamento

e correta conformação de E (Lindenbach and Rice, 2003; Lindenbach, 2001; Ocazionez and Fonseca 2000).

Com o intuito de investigar esta possibilidade foram construídos dois plasmídeos através da inserção dos genes de prM/DENV-2 e prM/DENV-3 no vetor plasmidial pCID2Et previamente construído a fim de expressar a proteína E/DENV-2 truncada (Ocazionez and Fonseca 2000).

Os plasmídeos foram denominados pCID2EtD2pM e pCID2EtD3pM, e expressavam respectivamente as proteínas prM/DENV-2-E/DENV-2 e prM/DENV-3-E/DENV-2.

O sequenciamento dos insertos clonados revelou alta identidade com os genes selvagens postados no banco de dados. Para pCID2EtD2pM, foi observada 98% de identidade e para o pCID2EtD3prM, 96%. Em relação à seqüência aminoacídica, o inserto de prM/DENV-2 apresentou 97% de seus aminoácidos traduzidos idênticos à proteína original e 98% de similaridade. Já o inserto prM/DENV-3, a identidade aminoacídica foi de 76% e a similaridade de 86% com a proteína prM do vírus DENV-3. Como existe a possibilidade de prM/DENV-3 desempenhar melhor função de chaperona do que prM/DENV-2, foi feito também o alinhamento da seqüência destas duas proteínas, resultando em 71% de identidade nucleotídica entre os mRNAs e 70% de identidade e 84% de similaridade entre seus resíduos de aminoácidos. No alinhamento das seqüências dos dois insertos foi observado 70% de identidade na seqüência de nucleotídeos e 75% de identidade e 91% de similaridade entre as seqüências aminoacídicas. Estes dados evidenciam que as proteínas prM/DENV-2 e prM/DENV-3 expressas

pelos plasmídeos recombinantes apresentam maior proximidade entre si do que a encontrada entre as proteínas prM dos DENV-2 e DENV-3.

Os plasmídeos pCID2EtD2prM, pCID2EtD3prM e pCID2Et foram utilizados para imunização de camundongos para avaliação de indução da resposta imune induzida pelos candidatos vacinais.

No ELISA, após 3 inoculações, constatamos 40% a mais de anticorpos específicos contra a proteína E/DENV-2 nos animais vacinados com pCID2EtD3prM em relação àqueles inoculados com pCID2Et. No grupo vacinado com pCID2EtD2prM, os níveis de anticorpos não apresentaram aumento após duas ou mesmo três doses, o que também foi observado por Konishi, onde os animais foram inoculados três vezes com 200 µg de plasmídeo expressando prM/E do DENV-2 (Konishi et al., 2000).

No ensaio de linfoproliferação, a melhor resposta dos animais vacinados com pCID2EtD3prM foi mantida. Neste caso, a diferença foi mais evidente quando o estímulo se faz com o MOI de 0,1, onde a proliferação alcançou 280% a mais em relação ao pCID2Et e 194% em relação ao pCID2EtD2prM. Além do mais, ambas as construções contendo prM